CN101019967A - 一种制备抗病毒的药物组合物的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备抗病毒的药物组合物的方法，主要原料为黄连、龙胆、谷精草和冰片，将其提取物作活性成分混合后，加入药学上可接收的辅料制备而成，黄连的提取方法为处方量的黄连加非极性溶剂或水回流提取，合并回流液；药液减压浓缩至浸膏状；取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脱脂，脱脂后加水转溶过滤，滤液浓缩至生药量的同倍重量，浓缩液加等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱至对碘化铋钾无明显反应，洗脱液减压浓缩至处方量的1/2重量，冷藏过滤至澄清。本发明工艺稳定、生物利用度高，制成滴眼液无毒、无刺激性及生物相容性良好，能防止或抑制病原微生物发育生长，不添加抑菌剂的状态下也能满足无菌要求。

Description

一种制备抗病毒的药物组合物的方法

技术领域

本发明属于医药领域技术领域，具体涉及一种包含黄连、龙胆、谷精草、冰片的抗病毒药物组合物的制备方法。

背景技术

中医药治疗的精华在于辨证论治、理法方药、君臣佐使来提高疗效。复方制剂的效果要明确高于单纯有效成分提取。但由于中药化学成分复杂，各种成份的理化反应很难把握。

在药物组合物制成各种药剂时，眼用制剂的要求较高，因此中药复方滴眼液很难满足澄明度、稳定性的要求。

眼用制剂一般为多剂量包装，使用过程中很容易染菌变质，其中绿脓杆菌的污染有可能造成严重后果，对于眼表疾病，尤其角膜创伤的病人后果更严重。因此，对于滴眼剂的无菌要求特别严格，以策安全。一般常规眼用制剂加入抑菌剂以防止染菌，但多数抑菌剂对眼粘膜都有刺激性和毒性，对角膜损伤的刺激或毒性更大。而且有研究报道，角膜创伤或眼科手术使用的滴眼剂不宜添加抑菌剂。

眼药水每次只能滴1-2滴，滴入结膜囊后要流掉2/3以上，滴入的一小部分药液与泪液混合，通过角膜转运入眼。所以滴眼的生物利用度甚小。研究表明只要持续保持结膜囊药物浓度就能大大提高药物的利用度。

发明人的另一发明专利“一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物及其制备方法”，(公告号：CN1663585公告日为2005年9月7日)提供一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物，是以黄连、龙胆、谷精草和冰片为主原料的提取物组成，黄连的主要成分小檗碱对革兰氏菌及葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、百日咳杆菌等均有较强的抑菌作用，尚具有抗真菌、抗病毒、抗炎作用。龙胆的主要成分龙胆苦苷具有清热利胆、抑菌作用，能减轻肝细胞坏死和肝细胞病变程度，并具有较强的抗炎活性；谷精草的主要成分为酚类，在试管内对真菌有抑制作用；冰片的主要成分为龙脑、异龙脑，具有防腐、抑菌、抗炎作用，局部可刺激冷觉感受器，具有清凉感，并具有止痒、止痛及轻微的局麻作用。包含黄连、龙胆、谷精草、冰片的药物组合物对抗病毒尤其是单纯疱疹病毒具有较好的效果。此工艺方法制得的滴眼液稳定性不理想，制剂易析出沉淀。

发明内容

本发明旨在将上述发明中公开的包含黄连、龙胆、谷精草、冰片的抗病毒药物组合物，根据中药材的药性作用及理化性质，提供一种工艺稳定、生物利用度高、不含抑菌剂而不易染菌变质的中药组合物的制备方法。采用本发明方法制成的滴眼液具有无毒、无刺激性及良好的生物相容性外，尚能防止或抑制病原微生物发育生长，在不添加抑菌剂的状态下也能满足无菌或达微生物限度要求，同时因为不含抑菌剂，制备的滴眼剂更适合于眼部的应用。

为实现本发明目的采用如下技术方案：

一种制备抗病毒的药物组合物的方法，所述的药物组合物的主要原料为黄连、龙胆、谷精草和冰片，将主要原料的提取物作活性成分混合后，加入药学上可接收的附加剂制备而成，其特征在于所述黄连采用如下提取方法：

(1)处方量的黄连加非极性溶剂或水回流提取，合并回流液；

(2)药液减压浓缩至浸膏状；

(3)取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脱脂，脱脂后加水转溶过滤，滤液浓缩至生药量的同倍重量，浓缩液加等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱至对碘化铋钾无明显反应，洗脱液减压浓缩至处方量的1/2重量，冷藏，过滤至澄清。

上述步骤(1)中非极性溶剂优选原药材的10倍体积量，回流3次，每次90分钟。

进一步，所述龙胆草的提取步骤如下：

(1)处方量的龙胆加非极性溶剂或水浸泡，回流提取，合并回流液；

(2)药液减压浓缩至浸膏状，浓缩温度为20～60℃；

(3)取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脱脂，脱脂后加水转溶过滤，滤液浓缩至生药量的同倍重量，浓缩液加等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱至薄层鉴别无龙胆苦苷斑点出现，洗脱液减压浓缩至处方量的1/2重量，冷藏，过滤至澄清。

上述的非极性溶剂为95％的乙醇。本发明组合物由黄连、龙胆、谷精草、冰片四味药材组成，黄连、龙胆为君药和臣药，黄连主要成分小檗碱，龙胆主要成分龙胆苦苷在热乙醇中溶解度大，且遇热较稳定，又可避免水溶性杂质，所以优选醇尤其是乙醇作为溶媒提取。

谷精草成分国内外尚无文献报告，国内外文献报道较少，主要含酚类、黄酮类(CA1991；115：110604a)，可溶于水及醇，由于谷精草含有叶绿素，较优选以水提取。本发明的谷精草提取步骤如下：

(1)处方量的谷精草加水或甲醇或乙醇中浸泡，煎煮；

(2)药液浓缩至谷精草原药重量，冷藏，过滤除杂；

(3)浓缩液加等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱，收集PH4.5～5.0洗脱液，洗脱液减压浓缩。

本发明所述药物组合物制备为滴眼剂的步骤包括将黄连、龙胆和谷精草提取物加水转溶混合后冷藏，经离心后取上清液，加等渗剂、增黏剂和稳定剂和处方量的冰片，调节药液的PH值为5.5～6.8，过滤，滤液充氮、灭菌分装；

所述组成和含量百分比为：

黄连提取物      相当于黄连的处方量

龙胆提取物      相当于龙胆的处方量

谷精草提取物    相当于谷精草的处方量

冰片            处方量

稳定剂          0.1％

等渗剂          2.0％

增黏剂          3.0％

                              

注射用水  加至  1000ml。

所述等渗剂选自Nacl、硼酸、葡萄糖、硼砂和甘露醇；优选为甘露醇。

所述增黏剂选自甲基纤维素、聚乙烯酸、聚乙二醇、羟丙基乙基纤维素、聚维酮，优选为聚维酮。

所述稳定剂选自EDTA.2Na、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸、硫代硫酸钠，优选为EDTA.2Na。

本发明提供的制备方法制得的以黄连、龙胆、谷精草、冰片为主要原料的药物组合物，无菌、毒性与刺激性，不含抑菌剂，用药安全，且具有高的稳定性。本发明制备方法相比现有的提取工艺具有如下有益效果：

(1)以非极性溶剂提取黄连中主要成分小檗碱和龙胆中主要成分龙胆苦苷，提高了有效成份的提取率，最大限度减少了水溶性杂质。

(2)本制备方法采用聚酰胺柱层析，有效地确保了制剂的澄清度且不影响药效。

(3)不添加抑菌剂达菌杆要求，避免抑菌剂影响澄清度以及对眼部的刺激，有利于角膜的修复。

说明书附图

图1为实施例1的黄连提取工艺流程图；

图2为实施例1的龙胆提取工艺流程图；

图3为实施例1的谷精草提取工艺流程图；

图4为实施例1制备滴眼剂的工艺流程图。

具体实施方式

本发明的抗病毒药物组合物由黄连、龙胆、谷精草、冰片四味药材分别提取精制而成，具有清热解毒，退赤消肿功效，临床用于治疗急性结膜炎及病毒性角膜炎。其中黄连为君药，小檗碱为本品的主要有效成分之一。小檗碱具有清热解毒、抑菌、抗真菌、抗病毒、抗炎等多种生理活性；龙胆为臣药，龙胆苦苷为主要有效成分，具有明显的抗炎作用及不同程度抑菌作用；谷精草主要成分为酚类，可能具有增强局部血流量，改善微循环作用；冰片成分为龙脑，具有防腐、抑菌、抗炎作用。本发明的制备方法制得的滴眼剂或喷剂或贴剂，测其小檗碱、龙胆苦苷各自的总固体量及主要活性成分含量、制剂澄明度和毒性和刺激性，结果证明。制备的各种剂型尤其是滴眼液无毒、无刺激性及良好的生物相容性，而且防止或抑制病原微生物发育生长，在不添加抑菌剂的状态下也能满足本品无菌或达微生物限度要求，更适合于眼部的应用。

本发明以下的实验例采用如下检测方法：

(1)黄连工艺总固体测定：精密称取10g药材(黄连)9份，回流提取、滤过，合并滤液，减压回收乙醇(60℃)，残液置蒸发皿中水浴蒸干后，按中国药典2000年版一部规定方法烘干恒重，于天平上称重，计算总固体量。

小檗碱含量测定：

供试液的制备精密称取黄连总固体0.1g，加水溶解，定容至100ml，从中取2ml离心(10,000r/min，5min)，上清液即为供试液。

色谱条件

色谱柱：Eclipse-XDB-C18(150×4.6mm)5m

流动相：乙晴一水一十二烷基硫酸钠(500∶500∶1g)

检测波长：254nm    柱温：18℃    流速：1.5ml/min

经***适用性试验、耐用性实验以及流动相实验(流速对主成分分离影响实验、流动相以及流动相比例对主成分影响、柱温对主成分离的影响以及PH值对主成分小檗碱的保留时间及与其他峰的分离度)，确定上述条件，流动相的pH值、流速及柱温影响较小，也显示本条件的耐用性较差，须严格按照所定条件进行试验。

本制备方法通过回收率试验(准确度试验)，考察其它三主要原料以及辅料对小檗碱的影响，平均回收率为100％。精密度试验确定本高效液相法检测小檗碱准确、可靠、稳定性好。

(2)龙胆提取工艺总固体测定精密称取10g药材(龙胆)，按实验设计进行回流提取、滤过，合并滤液，减压回收乙醇(50℃)，残液置蒸发皿中水浴蒸干后，按中国药典2000年版一部规定方法烘干恒重，于天平上称重，计算总固体量。

龙胆苦苷含量测定

供试液的制备精密称取龙胆总固体0.1g，加水溶解，定容至100ml，从中取2ml离心(10,000r/min，5min)，上清液即为供试液。

色谱条件

色谱柱：Eclipse-XDB-C18(250×4.6mm)5μm

流动相：乙腈：水(20∶80)

检测波长：270nm    柱温：25℃    流速：1.0ml/min

在含量测定***适用性试验中，对照品5次重复进样峰面积的RSD％达到1.0％以下，符合精密度的要求，

本制备方法通过回收率试验(准确度试验)考察其它三主要原料以及辅料对龙胆苦苷的影响，平均回收率可到99.33％，精密度试验确定本高效液相法检测龙胆苦苷准确、可靠、稳定性好。

实施例1滴眼剂的制备方法

本实施例处方量为：黄连1.2Kg；龙胆草1.2Kg；谷精草1.0Kg；冰片适量。

投料生药黄连为炮制切薄片；龙胆为炮制切段；谷精草为炮制后切段。

黄连提取工艺，参见图1：

(1)醇热提取：按处方量称取黄连，加95％乙醇12L浸泡45min，加热回流90min，共回流提取3次，每次均加药材的10倍量溶剂。

(2)分离：经提取后将药渣和提取液通过压滤，可挤出药渣内所吸附的药液，合并3次提取液，再通过压滤进一步除去药液中的混悬物，以提高提取药液的澄清度。

(3)浓缩；取分离所得药液置浓缩锅中于60℃减压浓缩至浸膏状(除尽乙醇)。

(4)精制

a.脱脂：取浸膏，加30～60℃石油醚浸泡过夜，倾出石油醚(石油醚可回收重复利用)，浸膏挥尽残留石油醚。

b.转溶：取上述浸膏，加水转溶，冷藏过夜，滤液浓缩至生药量的1∶1。

c.柱层析：浓缩液加聚酰胺粉(1∶1)拌匀，加在预先以水为溶剂填装的5.3×59cm的聚酰胺柱顶。用水洗脱至对碘化铋钾几无反应，洗脱液于60℃减压浓缩至处方量的1/2，冷藏过夜，过滤至澄清，即得P1，测定小檗碱含量为6％。

龙胆提取工艺，参见图2：

(1)醇热提取  按处方量称取龙胆，加95％乙醇12L浸泡45min，以下同黄连提取方法。不同的是回流时间为60min，回流2次，浓缩温度为50℃。

(2)分离  同黄连提取分离方法。

(3)浓缩  同黄连浓缩方法。

(4)精制

a.脱脂：同前。

b.转溶：同前。

c.柱层析：浓缩液加聚酰胺粉(1∶1)拌匀，加在预先以水为溶剂填装的5.3×59cm的聚酰胺柱顶。用水洗脱至薄层鉴别无龙胆苦苷斑点出现，洗脱液50℃减压浓缩至处方量的1/2，冷藏过夜，过滤至澄清，即得P2，测定龙胆苦苷含量3.1mg％。

谷精草提取工艺，参加图3：

(1)水提取按处方量称取谷精草，加水浸洗1次，浸泡2h，煎煮60min，共3次，每次加水量为20体积倍量。

(2)分离经提取后将药渣和提取液通过压滤，可挤出药渣内所吸附的药液，合并3次提取液，再通过压滤进一步除去药液中的混悬物，以提高药液的澄清度。

(3)浓缩取分离所得药液置浓缩锅中于60℃减压浓缩至1∶1浓缩液，冷藏过夜，过滤，进一步除去叶绿素等杂质。

(4)精制浓缩液通过聚酰胺柱(同黄连提取方法)，用水洗脱，收集pH4.5～5.0洗脱液，并于60℃减压浓缩，即得P3。

制备滴眼液，参见图4

黄连提取物(P1相当于生药1.2Kg)

龙胆提取物(P2相当于生药1.2Kg)

谷精草提取物(P3相当于生药1Kg)

冰片             0.3Kg

EDTA·2Na        0.1％

甘露醇           2.0％

                                 

聚维酮(PVP)      3.0％

注射用水  加至   1000ml

取P1、P2、P3加水转溶后的混合药液，分装预盐水瓶中，密封，100℃，加热30min，冷至室温，置5℃以下冷藏3天。

冷藏液离心(4,000r/min)后分离上清液，加甘露醇及EDTA·2Na，加热使溶解，冷至室温，加入聚维酮溶解后，再加入预溶于无水乙醇中的冰片，搅匀，调pH至5.5～6.8，过滤，滤液充氮，分装，灭菌(100℃×30min)。

灭菌药液置无菌室过滤(0.8μm微孔滤膜)，无菌分装，即得成品(每瓶5ml)，按标准要求进行检漏和质检。

滴眼液的稳定性试验

滴眼液(250ml，100℃×30min灭菌)常温放置三个月未见澄明度改变；pH下降幅度不大(从考察前pH6.3降至pH5.9)；外观色泽无明显改变；三批样品薄层色谱鉴别活性成分小檗碱和龙胆苦苷斑点无改变，测三批主要活性成分小檗碱含量(mg/ml)1.2428、1.3018、1.1385，均在限度以上(不低于1mg/ml)。

而在相同条件下，采用配比量的黄连经盐酸溶液，浸泡煎煮同样时间而制得药物组合物的活性成分的小檗碱含量(mg/ml)为0.9921、1.0210、0.9741。

滴眼液的细菌数检测：细菌数≤100个/ml，无霉菌(酵母菌)，铜绿假单胞杆菌和黄色金葡萄菌。

实验证明考察表明，本发明制备的滴眼液在常温下较稳定，制备工艺合理、稳定且提高了活性成分的提取率，而且在不添加抑菌剂达到菌杆要求。

实施例2

本实施例黄连、龙胆提取工艺相同于实施例1，不同的是谷精草采用常规水煎煮提取方法。另外以下条件和用量做出变化：

1、溶剂浓度改变：

含黄连的复方中药制剂一般使用水和一定浓度的乙醇提取，本发明方法为加热提取，本实施例以水、50％乙醇、95％乙醇作为溶剂分别总固体浸出量及溶液澄明度。

按处方比例称取干燥药材，黄连、龙胆各10g，分别加12倍量水、50％乙醇、95％乙醇，浸泡30min后加热回流提取1.5h，冷至室温，过滤，滤液分别减压浓缩(60℃)至干，真空干燥24h，精密称量即得总固体浸出量；分别称取固体1g，加水溶解，冷藏过夜，过滤，定容至50ml，密封，100℃×30min，室温存置3天，观察溶液观察溶液澄明度。

本试验通过设计以水、50％乙醇、95％乙醇3种具有代表性溶剂的总固体浸出量及溶液澄明度。结果见下表1。

表1：

	总固体浸出量		澄明度
				黄连	水	2.23	+++
50％乙醇	2.85	++
			95％乙醇		1.07	-
龙胆	水	1.32					+++
			50％乙醇	1.80	++
	95％乙醇	1.45				-

注：+++溶液浑浊，无沉淀，++溶液澄清；-溶液澄清度极好。

结果：处方药材黄连以50％乙醇浸出率(总固体量)最高，水次之，95％乙醇浸出率较低，溶液澄明度则以95％乙醇最佳；而95％乙醇提取制成水溶液的小檗碱含量达2mg/ml以上(HPLC法)即达到盐酸小檗碱的饱和溶解度(1∶500)，足以发挥治疗作用，并能确保滴眼剂的澄明度，因此选择95％乙醇作为提取溶剂。龙胆也以95％乙醇为佳(HPLC法，0.5mg/ml)，水转溶后的澄清度也比其他溶剂好。

2、黄连(P1)提取工艺中热非极性溶剂的提取时间、次数和溶剂量改变提取时间分别取60、90、120min，提取次数为1、2、3次和溶剂量为8、10、12倍。其它相同于实施例1中黄连提供工艺方法，测得总固体量和小檗碱含量如表2所示

实验结果见下表2：

表2

试验号	提取时间	次数	溶剂量	总固体(％)	小檗碱(mg％)
						1	60	1	8	8.52	3.5
2	60	2	10	19.78	4.5
						3	60	3	12	22.79	4.5
4	90	1	10	15.19	5.1
						5	90	2	12	20.69	4.2
6	90	3	8	24.25	5.9
						7	120	1	12	13.76	4.9
8	120	2	8	20.56	5.1
						9	120	3	10	20.29	5.0

从表2中可看出，采用黄连加12倍乙醇，回流3次，每次90分钟，总固体高；采用黄连加10倍乙醇，回流3次，每次90分钟小檗碱含量高。

从实际工艺考察，药材乙醇10倍量，回流3次，每次90分钟即实施例1中的条件，方案最佳。即：按处方比例准确称取黄连药材，加10倍量乙醇浸泡30min后，加热回流1h，重复回流3次，过滤，合并滤液，减压浓缩(60℃)，除尽乙醇，加水转溶，冷藏24h，过滤，滤液过聚酰胺柱，水洗至颜色极淡为止(对碘化铋钾几无反应)，减压浓缩至处方量的1/2，即得p1(总生物碱)。以最优选的工艺重复实验，结果如下表3

表3最优工艺重复试验结果(n＝3)

重复试验样品	总固体转移率(％)	小檗碱转移率(mg％)
			1	26.25	5.1
2	28.29	5.9
			3	36.67	5.1
X±SD	30.40±5.5	5.4±0.5

实施例3

本实施例黄连、龙胆提取工艺和谷精草工艺均相同于实施例1，另外以下条件和用量做出变化：

1、溶剂浓度改变：

本实施例黄连、龙胆、谷精草提取工艺相同于实施例1，不同的是以下条件和用量的变化：

龙胆(P2)提取工艺中热非极性溶剂的提取时间、次数和溶剂量改变。

提取时间分别取60、90、120min，提取次数为1、2、3次和溶剂量为8、10、12倍。其它相同于实施例1中黄连提供工艺方法，测得总固体量和小檗碱含量如表2所示

实验结果见下表4：

表4

试验号	提取时间	次数	溶剂量	总固体(％)	龙胆苦苷(mg％)
						1	60	1	8	12.83	3.52
2	60	2	10	16.77	2.38
						3	60	3	12	18.70	2.98
4	90	1	10	13.11	3.54
						5	90	2	12	18.55	2.57
6	90	3	8	32.22	1.79
						7	120	1	12	16.94	1.12
8	120	2	8	33.74	2.38
						9	120	3	10	32.42	1.98

从表4中可看出，采用龙胆加8倍乙醇，回流3次，每次120分钟，总固体高；采用龙胆加8倍乙醇，回流1次，每次60分钟龙胆苦苷含量高。但是由于龙胆苦苷受热不稳定，并从实际工艺考察，采用药材乙醇10倍量，回流2次，每次60分钟为最佳。

最优工艺重复试验，按处方比例准确称取龙胆药材(10g，3份)，分别加10倍量乙醇浸泡30min后，加热回流1h，重复回流2次，过滤，合并滤液，减压浓缩(50℃)，除尽乙醇，加水转溶，冷藏24h，过滤，滤液过聚酰胺柱，水洗至薄层层析无龙胆苦苷斑点为止，减压浓缩至处方量的1/2，即得P2(龙胆苦苷等)。试验结果，见表5

表5最优工艺重复试验结果(n＝3)

重复试验样品	总固体转移率(％)	龙胆苦苷转移率(mg％)
			1	18.37	3.05

2	17.97	3.02
			3	18.60	3.09
X±SD	18.31±0.32	3.05±0.04

从实验结果看，提取时提取时间、次数和溶剂用量对龙胆苦苷的提取率有显著影响，其中提取时间影响较大，次之提取次数。由于龙胆苦苷为裂环环烯醚萜苷衍生物，其水溶性苷类易被水解，受热能促进水解或分解，总固体的得率与有效成份龙胆苦苷无相关性，所以出现总固体得率高的样品龙胆苦苷含量低的原因。根据实验证明提取时间对龙胆苦苷的得率或含量的影响有显著性意义，提取次数次之，而醇溶媒的用量影响较小。根据重复试验结果，并从整体工艺考察，提取龙胆的优选工艺条件为药材乙醇10倍量，回流2次，每次60分钟。

实施例4

本实施例主要变化谷精草提取工艺条件。

谷精草具有疏散风热，明目，退翳等作用。用于治疗目疾，自《开宝本草》、《本草纲目》即有记载。谷精草为谷精草科植物Eriocaulon buergerianum Koern的干燥带花茎的头状花序。有关谷精草的化学成分初步试验为酚类成分，但至今尚未清楚，也未见谷精草有效成份等研究报告。由于本发明滴眼液君药黄连主成分小檗碱为季铵生物碱对酸碱敏感，遇酸性物质易发生沉淀反应，因此，本发明谷精草提取工艺主要以提取谷精草中水溶性酚类成分及这些未知成分与本发明药物组合物中其它已知成分配伍后对滴眼液的澄明度影响为考察指标。尽管不能定量反映谷精草最佳工艺条件，但从控制滴眼剂澄明度，能确保制剂质量，以求整体工艺稳定、可行。

根据谷精草中可能有水溶性酚类成分及叶绿素，采用水为提取溶媒。

按处方比例称取干燥药材各9份，黄连和龙胆按实施例1所述工艺分别制备，谷精草按一般水提法，

谷精草加水煎煮2次，每次1h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至每毫升含药材1g，冷藏过夜，离心，除去叶绿素等杂质，离心液加石油醚于30～60℃脱脂，脱脂后浓缩液继续减压于60℃浓缩成浸膏加水溶解，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶(50g生药水提取物，30～60目的聚酰胺粉25g，装入2.5cm×30cm玻璃柱)。依次以水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇、95％乙醇洗脱，水洗脱收集pH3.5～4.0和pH4.5～5.0两份(简称酸性水和中性水)，每份约80ml；其它每种溶剂洗至约80ml时换下种溶剂。含乙醇溶剂分别减压(60℃)浓缩除尽乙醇，加水转溶，冷藏过夜，滤过，澄清液供如下试验用。

取每份洗脱液2ml，分别进行鞣质、蛋白质、草酸盐等检查，结果见表6。

表6谷精草提取液影响质量项目检查

样品	澄清度	pH	草酸盐	蛋白质	鞣质(酚类)
						酸性水	澄清	3.2	+++	-	-
中性水	澄清	5.1	-	-	+++
						30％乙醇	澄清	5.5	-	-	++
50％乙醇	澄清	5.2	-	-	++
						80％乙醇	澄清	5.0	-	-	+++
95％乙醇	微混	5.2	-	-	+++

+++：沉淀明显，呈色明显；++：中等程度呈色；-：对澄清度无影响。

草酸盐：用1％氯化钙、氯化钡试液检查；

蛋白质：30％磺基水杨酸试液或鞣酸试液；

鞣质(酚类)：1％三氯化铁试液、香草醛-盐酸试剂及0.1％咖啡碱水溶液。

表6提示，谷精草水提液含有机酸，主要为草酸盐，试验证明氯化钡试液产生的白色沉淀为不溶于稀醋酸的草酸钡。中性水洗脱液及各浓度乙醇洗脱液均对三氯化铁试液呈明显反应，经香草醛-盐酸试剂及咖啡碱排除试验表明，样品对三氯化铁显色反应主要是酚类，说明谷精草酚类成分可被聚酰胺吸附，可用水和不同浓度的乙醇洗脱。

处方各组分配伍对澄清度的影响：取每份洗脱液10ml，分别加入黄连、龙胆提取液，观察对澄清度的影响，结果见表7。

表7组分配伍对澄清度的影响

样品	黄连提取液	龙胆提取液	黄连、龙胆提取液
				酸性水	放置后变混浊	放置后变混浊	放置后变混浊
中性水	…-	-	-
				30％醇	微混	-	微混
50％乙醇	微混	-	微混
				80&乙醇	沉淀	-	沉淀
95％乙醇	沉淀	-	沉淀

-：澄清度无影响。

表7表明，酸性水显混浊是由所含草酸和其它提取液少量金属离子如Ca²⁺引起；乙醇洗脱液的某些酸性酚类成分和黄连中小檗碱可发生沉淀反应，并出现明显沉淀；由于小檗碱为季铵(碱)型生物碱，成盐方式和pH有关，因而混合液可以随着放置时间而逐渐形成沉淀。龙胆提取液与样品液配伍后外观无影响。

实施例5主原料提取物合成组合物的工艺对主成分的影响

样品制备：按实施例1所述的工艺提取加水转溶的混合物(黄连、龙胆、谷精草)30ml，均分4份，照下述方法分别处理：

样品A：未处理置水浴，70℃减压浓缩至干；

样品B：离心(10,000r/min)后，上清液于70℃减压浓缩至干；

样品C：减压浓缩至1/2体积，加入2％壳聚糖溶液，置80℃水浴加热片刻，冷至室温，过滤，滤液减压于70℃浓缩至干；

样品D：水转溶后分别经聚酰胺处理后的混合液(与上述样品药材量相等，P1+P2+P3)，减压浓缩至干。

样品测定：取上述样品分别加入10ml乙醇，超声提取5分钟，离心(4,000r/min，5min)后，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定小檗碱含量，结果见表8。

表8

样品编号	峰面积	小檗碱含量mg％
			A	5360.3	12.34
B	4962.3	11.40
			C	1887.1	4.02
D	2107.9	4.56

对澄清度的影响：按上述样品处理方法，另取4份样品分别加水溶解，冷藏过夜，过滤，滤液装瓶密封，100℃加热30min，室温放置3天，观察澄清度，结果见表9。

表9

样品编号	溶液澄清度
		A	+++
B	++
		C	++
D	±

+++，溶液混浊，并出现沉淀

++，溶液混浊，少量沉淀

±，溶液澄清；

实验结果表明，壳聚糖处理样品(C)的小檗碱含量损失大，由于小檗碱为季铵碱而壳聚糖为含有酸性基团大分子，可能形成低水溶性沉出，造成小檗碱含量明显降低；样品(A)、(B)由于杂质影响，使澄清度明显下降，而样品(D)小檗碱含量虽偏低，经处方药材计仍可达到小檗碱的饱和溶解度(2mg/ml)，本发明方法(D)为最佳工艺方法。

实施例6滴眼剂的制备

本发明组合物提取部位主要为水溶性生物碱(季铵衍生物)、环烯醚萜苷及酚类等，故采用注射用水。注射用水应符合中国药典二部要求，其中pH应为5.0～7.0，氨不超过0.00002％，每1ml细菌内毒素含量不超过0.25EU。

制备滴眼剂添加等渗、等张调节剂、稳定剂和增黏剂等辅料。

本发明制备方法甘露醇为等渗调节剂，处方药材主成分的性质及产生的渗透压(127mOsm·L-1)，甘露醇具有络合作用，可作为抗氧增效剂。由于本发明药物组合物中主要成分小檗碱易氧化，龙胆苦苷易水解，因此甘露醇除调节渗透压，滴眼时产生清凉感外，尚能增加制剂的稳定性。产品用冰点下降法测定渗透压为270mOsm·L-1～335mOsm·L-1。

本发明制备方法需要根据主要成分的理化性质及其在水溶液的溶解性、稳定性、生理适应性和发挥最佳效能(疗效)调节pH，黄连中生物碱(小檗碱、黄连碱、巴马亭)pH偏酸(＜5)在水中溶解度极低(冷水中微溶或极微溶)，但随着pH的增高(＞6.5)季铵碱的离子化程度增加，水溶性也明显增大，而亲脂性也相对比盐酸盐或硫酸盐(小檗碱)强，有利于眼部吸收和疗效的发挥；龙胆苦苷为裂环环烯醚萜苷，苷元具有缩醛结构，化学性质活泼，易被水解、分解或聚合，溶液pH＞7加速苷的水解，随着pH增大可出现内酯环开裂、双键移位反应，而pH7附近水解缓慢。因此，本发明制备方法在合成滴眼剂的工艺步骤中pH应控制在5.5～6.8。

本发明制备滴眼液工艺中需加增黏剂，旨在增加有效成分的稳定性和药液的粘度，使药物与角膜接触时间延长，又能减低药物的刺激性，从而有利于药物的吸收。

实验一、取实施例1所述的黄连、龙胆和谷精草提取步骤制备的提取物，转溶后加入处方量的冰片，取药液200ml，均分四份样品，按下述方法分别处理：

样品编号(1)加入2％(w/v)聚乙烯醇PVA(1750±50)，搅匀，微孔滤膜(孔径：0.8μm)滤过至清；

样品编号(2)加入2％聚维酮PVP，搅拌溶解(PVP K-30，构自上海伯奥生物有限公司)，搅拌溶解，微孔滤膜过滤至清；

样品编号(3)加入0.5％甲基纤维素(400rps，英国进口分装)，搅拌至溶解，微孔滤膜过滤至清；

样品编号(4)不加附加剂；

与上述样品相同处理。将所有样品封口、灭菌(100℃，30min)，室温放置三个月观察澄清度。

取上述样品各10ml，水浴(70℃)减压至干，分别加入10ml乙醇，超声提取5分钟，，离心(4,000r/min，5min)后，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定小檗碱含量如下表10。

表10

样品编号	附加剂	小檗碱峰面积/含量mg％	澄清度(三个月)
				1	2％PVA	2092.2/4.5	少量絮状沉淀
2	2％PVP	3985.1/9.04	澄明
				3	0.5％甲基纤维素	1793.5/3.81	沉淀
4	不加增黏剂	1516.5/3.15	沉淀

结果：试验证明，样品编号(1)、(3)、(4)中的沉淀主要是小檗碱，由于小檗碱在水中溶解小，在灭菌、贮存过程中产生沉淀，增黏剂PVA和甲基纤维素明显影响溶液的澄清度，而PVP(样品编号2)可能通过络合增加小檗碱在水溶液中的溶解度，因此，样品编号(2)加增黏剂PVP不仅能增加药液的粘度，尚能使产品的稳定性明显改善。

由于本发明药物组合物中主成分为季铵生物碱，在碱性溶液中对热和光、氧、金属离子存在时很不稳定，易发生氧化、分解反应，而抗氧剂特别无机硫化物(亚硫酸盐类)、有机硫化物(半胱氨酸等)，易与滴眼剂中其他成分主要是龙胆苦苷(含双链和内酯环)发生加成反应，导致产生人为产物。因此选用EDTA-Na2、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸、硫代硫酸钠作为稳定剂，优选EDTA2Na作为稳定剂，产品在灭菌前充氮气，置换空气，从而达到阻止或延缓氧化降解反应的进行。

实施例7～12

取黄连、龙胆、谷精草和冰片，黄连8KG、龙胆草8KG、谷精草30～7KG、冰片0.2KG。

黄连采用如下提取方法：

黄连加非极性溶剂浸泡45min，回流提取，合并回流液，溶剂为原药材的10倍体积量，回流3次，每次90分钟。本发明实施例7～11非极性溶剂为甲醇、乙酸乙酯、***，实施例12采用水回流提取。提取后药渣和提取液可通过压滤，除去药液中混悬物；溶剂量选10倍生药体积量，加热回流90min，回流3次。

药液减压浓缩至浸膏状，除尽乙醇，浸膏在30～60℃的石油醚浸泡脱脂，脱脂后加水转溶过滤，滤液浓缩至生药量的同倍重量，浓缩液加大致等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱至对碘化铋钾无明显反应，洗脱液减压浓缩至处方量的1/2重量，冷藏，过滤至澄清。

龙胆草的提取：

处方量的龙胆加非极性溶剂浸泡45min，回流提取，合并回流液，提取后药渣压滤，合并提取液，除去药液中混悬物；本发明实施例7～11非极性溶剂为甲醇、乙酸乙酯、***。非极性溶剂或水用量为10倍，回流时间为60min，回流2次。

药液减压浓缩至浸膏状，浓缩温度为20～60℃，非极性溶剂或水取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脱脂，脱脂后加水转溶过滤，滤液浓缩至生药量的同倍重量，浓缩液加大约等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱至薄层鉴别无龙胆苦苷斑点出现，洗脱液减压浓缩至处方量的1/2重量，冷藏，过滤至澄清。

谷精草的提取：处方量的谷精草加水或甲醇或乙醇中浸泡1次，浸泡2h，煎煮60min，共3次，每次加溶剂量为20倍量，药渣和提取液压滤，合并提取液，除去药液中混悬物。

药液浓缩至谷精草原药重量，冷藏，过滤除杂；浓缩液加等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱，收集PH4.5～5.0洗脱液，洗脱液减压浓缩。

制备滴眼剂或者其它注射等剂型：将黄连、龙胆和谷精草提取物加水转溶混合后冷藏，经离心后取上清液，加辅料和处方量的冰片，调节药液的PH值为5.5～6.8，过滤，滤液充氮、灭菌分装；实施例7～17的等渗剂选自NaCl、硼酸、葡萄糖、硼砂和甘露醇；增黏剂选自甲基纤维素、聚乙烯酸、聚乙二醇、羟丙基乙基纤维素、聚维酮；稳定剂选自EDTA.2Na、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸、硫代硫酸钠。实验例的结果分析见下表11：

表11

	黄连、龙胆提取溶剂	谷精草提取溶剂	等渗剂	增黏剂	稳定剂	小檗碱含量mg％	澄清度(三个月)
								实施例7	甲醇	水	NaCl	甲基纤维素	EDTA.2Na	4.4	良好
实施例8	乙酸乙酯	甲醇	硼酸	聚乙烯酸	亚硫酸钠	4.2	良好
								实施例9	***	乙醇	葡萄糖	聚乙二醇	亚硫酸氢钠	3.9	良好
实施例10	石油醚	乙醇	甘露醇	羟丙基乙基纤维素	焦亚硫酸	4.1	良好
								实施例11	乙醇	水	甘露醇	聚维酮	硫代硫酸钠	4.2	良好
实施例12	水	水	甘露醇	聚维酮	EDTA.2Na	4.7	良好

Claims (10)

1、一种制备抗病毒的药物组合物的方法，所述的药物组合物的主要原料为黄连、龙胆、谷精草和冰片，将主要原料的提取物作活性成分混合后，加入药学上可接收的辅料制备而成，其特征在于所述黄连采用如下提取方法：

(1)处方量的黄连加非极性溶剂或水回流提取，合并回流液；

(2)药液减压浓缩至浸膏状；

(3)取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脱脂，脱脂后加水转溶过滤，滤液浓缩至生药量的同倍重量，浓缩液加等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱至对碘化铋钾无明显反应，洗脱液减压浓缩至处方量的1/2重量，冷藏，过滤至澄清。

2、如权利要求1所述制备抗病毒的药物组合物的方法，其特征是所述步骤(1)中非极性溶剂或水用量为原药材的10倍量，回流3次，每次90分钟。

3、如权利要求1所述制备抗病毒的药物组合物的方法，其特征是所述龙胆草的提取步骤如下：

(1)处方量的龙胆加非极性溶剂或水浸泡，回流提取，合并回流液；

(2)药液减压浓缩至浸膏状，浓缩温度为20～60℃；

(3)取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脱脂，脱脂后加水转溶过滤，滤液浓缩至生药量的同倍重量，浓缩液加等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱至薄层鉴别无龙胆苦苷斑点出现，洗脱液减压浓缩至处方量的1/2重量，冷藏，过滤至澄清。

4、如权利要求3所述制备抗病毒的药物组合物的方法，其特征是所述龙胆草的提取步骤中，非极性溶剂或水用量为龙胆草的10倍量，回流次数2次，回流60分钟。

5、如权利要求1～4之一所述制备抗病毒的药物组合物的方法，其特征是所述非极性溶剂为95％的乙醇。

6、如权利要求1～4之一所述制备抗病毒的药物组合物的方法，其特征是所述谷精草的提取步骤如下：

(1)处方量的谷精草加水或甲醇或乙醇中浸泡，煎煮；

(2)药液浓缩至谷精草原药重量，冷藏，过滤除杂；

(3)浓缩液加等重量的聚酰胺拌匀，加在预先以水为溶剂填装的聚酰胺柱顶，以水洗脱，收集PH4.5～5.0洗脱液，洗脱液减压浓缩。

7、如权利要求6所述制备抗病毒的药物组合物的方法，其特征是药物组合物制备为滴眼剂的步骤包括将黄连、龙胆和谷精草提取物加水转溶混合后冷藏，经离心后取上清液，加等渗剂、增黏剂和稳定剂和处方量的冰片，调节药液的PH值为5.5～6.8，过滤，滤液充氮、灭菌分装；

所述组成和含量百分比为：

黄连提取物        相当于黄连的处方量

龙胆提取物        相当于龙胆的处方量

谷精草提取物      相当于谷精草的处方量

冰片              处方量

稳定剂            0.1％

等渗剂            2.0％

增黏剂            3.0％

                            

注射用水  加至    1000ml。

8、如权利要求7所述制备抗病毒的药物组合物的方法，所述等渗剂选自Nacl、硼酸、葡萄糖、硼砂和甘露醇。

9、如权利要求7所述制备抗病毒的药物组合物的方法，其特征是所述增黏剂选自甲基纤维素、聚乙烯酸、聚乙二醇、羟丙基乙基纤维素、聚维酮。

10、如权利要求7所述制备抗病毒的药物组合物的方法，其特征是所述稳定剂选自EDTA.2Na、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸、硫代硫酸钠。