BRPI0716424A2 - Métodos terapêuticos para o tratamento de distúrbios vasculares do olho com antagonistas de dll4 - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS TERAPÊUTICOS PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS VASCULA- RES DO OLHO COM ANTAGONISTAS DE DLL4".

Esta invenção refere-se de modo geral a métodos para o trata- 5 mento de distúrbios vasculares e isquêmicos pela administração de compo- sições que inibem a interação de DII4 com receptores Notch, e/ou ativação de receptor Notch. Mais especificamente, esta invenção refere-se a métodos para o tratamento de distúrbios vasculares ou isquêmicos do olho pela ad- ministração de composições que inibem a interação de DII4 com receptores 10 Notch.

Antecedentes

A angiogênese é um processo fundamental requerido para o de- senvolvimento e crescimento normal de órgãos e tecidos, e envolve a forma- ção de novos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos preexistentes. 15 A angiogênese e a homeostase de vasos sanguíneos são rigorosamente controladas através de um sistema altamente regulado de moduladores an- giogênicos. O desvio de um controle tão rigoroso muitas vezes leva ou é as- sociado com doença.

Enquanto a angiogênese não regulada “excessiva” ou aberrante 20 é característica de numerosos estados de doença, a angiogênese insuficien- te, perda de vasos sangüíneos ou oclusão de vaso sangüíneo funcional ou estrutural também pode ser um sério problema médico. Promover a angio- gênese e/ou prevenir a regressão de vasos sangüíneos existentes é desejá- vel em situações onde o tecido se torna isquêmico, por exemplo, em isque- 25 mia da retina, cerebral, cardiovascular e do limbo e em condições onde um suprimento vascular deve ser estabelecido, restabelecido, melhorado ou ex- pandido, por exemplo, em cicatrização e após transplante de tecido ou ór- gão, ou para estimular o estabelecimento de vasos colaterais ou senão au- mentar a perfusão de um tecido ou órgão com circulação inadequada.

A via de sinalização Notch é um sistema para comunicação célu-

la a célula usado por uma ampla faixa de eucariotos para muitos processos biológicos, tal como diferenciação, proliferação e homeostase (Artavanis- Tsakonas et al. (1999) Science 284:770 - 776). A sinalização Notch também tem sido implicada no controle do desenvolvimento vascular (Iso et al. (2003) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23:543 - 553).

O Delta-Iike 4 (DI4) ou ligando delta-like 4 (dll4) (daqui a diante “DII4”) é um membro da família Delta de Iigandos Notch, o qual exibe ex- pressão altamente seletiva pelo endotélio vascular (Shutter et al. (2000) Ge- nes Dev. 14:1313 - 1318). O DII4 é um ligando para receptores Notch, inclu- indo Notch 1 e Notch 4. As seqüências de ácido nucléico e de aminoácido para DII4 humano e de camundongo são mostradas em SEQ ID NO:1 - 2 e SEQ ID NO:3 - 4, respectivamente. Camundongos de gene-alvo DII4 foram gerados (see, por exemplo, Duarte et al. (2004) Genes Dev. 18:2474 - 2478; Krebs et al. (2004) Genes Dev. 18:2469 - 2473: Galé et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:15949 - 15954). Estes estudos mostraram que o DII4 foi altamente expresso sobre os vasos sangüíneos em desenvolvimento no em- brião do rato, e que a deleção genética de mesmo um único alelo de DII4 resultou em Ietalidade embriônica, associada com acentuadas anormalida- des vasculares.

Breve Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de do- enças que afetam o sistema cardiovascular com agentes capazes de blo- quear a interação de DII4 com seus receptores (“antagonistas de DII4”). Os resultados experimentais proporcionados aqui suportam o uso de antagonis- tas de DII4 para o tratamento de doenças caracterizadas por neovasculari- zação patológica e insuficiência vascular, onde a insuficiência vascular é devido à perda de vasos sangüíneos ou mudanças funcionais vasculares que resultam em perfusão insuficiente de tecido. Os antagonistas de DII4 são particularmente úteis para o tratamento de distúrbios vasculares do olho, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade e outras doenças oculares caracterizadas por angiogênese patológica e/ou isquemia da retina, tal como veia da retina ou oclusão arterial.

A inibição farmacológica de DII4 é mostrada para exercer diver- sos efeitos benéficos em um modelo de retinopatia isquêmica, incluindo ate- nuação da perda de vasos sangüíneos quando aplicada no momento de uma lesão que leva à perda de vasos sangüíneos, e supressão do desenvol- vimento de mudanças patológicas na vascularização ao mesmo tempo em que aumenta a rebrotação de mais vasos sangüíneos normais, funcionais 5 quando aplicada em seguida ao estabelecimento da isquemia.

Espera-se que os agentes farmacológicos que inibem a sinaliza- ção DII4 sejam similarmente benéficos no tratamento de outras formas de lesão isquêmica, incluindo isquemia cerebral, isquemia cardíaca e condições isquêmicos que afetam o limbo e outros órgãos e tecidos do corpo. Também 10 se espera que os inibidores de DII4 sejam clinicamente benéficos em outras condições que requerem o estabelecimento ou restabelecimento de um su- primento vascular ou que, de outra forma, se beneficiem da perfusão aumen- tada de tecido. Exemplos de tais condições são más formações arterioveno- sas, cicatrização, transplante de órgãos e tecidos e insuficiência placentária. 15 Conforme mostrado no trabalho experimental relatado abaixo, a inibição de DII4 previne o estreitamento e a oclusão arterial, indicando que os inibidores de DII4 também seriam eficazes no tratamento de hipertensão sistêmica ou pulmonar, e distúrbios relacionados.

Os antagonistas de DII4 mostraram-se agora ser eficazes em promover angiogênese produtiva tanto em condições normais quanto pato- lógicas. Especificamente, bloquear a sinalização DII4-Notch mostrou aumen- tar a brotação angiogênica e a proliferação de células vasculares endoteliais na vascularização em desenvolvimento da retina, e suprimir a formação de neovascularização ectópica patológica e o desenvolvimento de derivações arteriovenosas em favor de uma formação mais apropriada de vasos na reti- na isquêmica. Além disso, a aplicação de bloqueadores de DII4 no momento de lesão do vaso mostrou reduzir acentuadamente a perda subseqüente de vasos sangüíneos. Estas descobertas suportam o uso de um antagonista de DII4 no tratamento de doenças do olho caracterizadas por anormalidades vasculares, especialmente quando acompanhadas por isquemia e perda de vasos normais. Exemplos de tais doenças do olho incluem retinopatias is- quêmicas, tal como degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia central da retina ou oclusão de ramo da veia da retina, retinopatia dia- bética e retinopatia da prematuridade.

Em um primeiro aspecto, a invenção retrata um método de tra- tamento de distúrbio ou doença do olho caracterizada por anormalidades 5 vasculares, que compreende a administração de um antagonista de DII4 a um indivíduo em necessidade do mesmo. O método da invenção promove o crescimento de vasos funcionais normais, inibe o crescimento de vasos a- normais ou desordenados e previne a regressão patológica da vasos san- güíneos.

Em uma modalidade, o antagonista de DII4 é um anticorpo ou

fragmento de anticorpo, o qual liga especificamente o DII4 e bloqueia a liga- ção do DII4 a um receptor Notch (por exemplo, receptores Notchl e Notch4). Em outra modalidade, o antagonista de DII4 da invenção é uma proteína ou fragmento de proteína que compreende o domínio extracelular de DII4 ou um 15 fragmento do mesmo, o qual em modalidades específicas pode ser fundido a um componente de multimerização e o qual liga receptores Notch sem ativá- los, desse modo bloqueando as ações do DII4 endógeno.

O distúrbio ou doença do olho tratado pelo método da invenção é um distúrbio da vascularização ocular caracterizado pela presença de va- 20 sos anormais e/ou perda de vasos normais ou função normal de vaso. Em modalidades específicas, a condição ou distúrbio tratado inclui retinopatia da prematuridade, retinopatia isquêmica, oclusão da veia ou artéria da retina, retinopatia diabética, neovascularização coroidéia, degeneração macular relacionada à idade, neovascularização da córnea, glaucoma neovascular ou 25 transplanta da córnea.

O anticorpo ou fragmento de anticorpo usado no método da in- venção pode ser policlonal ou monoclonal, e pode ser humanizado, quiméri- co ou plenamente humano. Preferentemente, o anticorpo é um anticorpo plenamente humano monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal. O 30 fragmento de anticorpo pode ser um anticorpo de cadeia única, ScFv, um Fab ou um F(ab’)2.

Quando o antagonista de DII4 é uma proteína ou fragmento de proteína, o fragmento é preferentemente o domínio extracelular de DII4 ou um fragmento ou fragmento modificado do mesmo, e pode ser fundido a um componente de multimerização. O componente de muftimerização é preferi- velmente um domínio de imunoglobulina, tal como, por exemplo, um domínio 5 de Fe, por exemplo, um Fc humano (SEQ ID NO:5). A proteína pode opcio- nalmente compreender uma seqüência de sinal, o qual pode ser nativo à célula, recombinante ou sintético.

Em um aspecto mais amplo, o método da invenção é útil no tra- tamento de qualquer doença ou condição isquêmica causada por suprimento 10 de sangue insuficiente devido à perda de vaso sanguíneo e/ou perfusão po- bre, por exemplo, lesão isquêmica, isquemia cerebral, isquemia cardíaca, condições isquêmicas que afetam os limbos e outros órgãos ou tecidos, más formações arteriovenosas, cicatrização, transplante de órgãos ou tecidos, insuficiência placentária, estreitamento e oclusão arterial, aterosclerose e 15 hipertensão sistêmica ou pulmonar.

Em um segundo aspecto, a invenção provê o uso de um agente capaz de inibir a atividade de DII4 na fabricação de medicamento para tratar, inibir ou melhorar um distúrbio isquêmica ou vascular, em que o antagonista de DII4 é um anticorpo ou fragmento de anticorpo capaz de bloquear a Iiga- 20 ção de DII4 a um receptor Notch, ou um fragmento de DII4 opcionalmente conectado a um componente de multimerização (tal como em domínio de Fe). Em uma modalidade, o distúrbio isquêmico ou vascular é uma doença ou condição do olho caracterizada pela presença de vasos sangüíneos a- normais e/ou perda de vasos sangüíneos normais ou função de vaso. A do- 25 ença do olho é a retinopatia da prematuridade, retinopatia isquêmica, oclu- são da artéria ou veia da retina, retinopatia diabética, neovascularização co- roidéia, degeneração macular relacionada à idade, neovascularização da córnea, glaucoma neovascular ou transplante da córnea.

Em outra modalidade, o distúrbio isquêmico ou vascular é lesão isquêmica, isquemia cerebral, isquemia cardíaca, condições isquêmicas que afetam os limbos e outros órgãos e tecidos, más formações arteriovenosas, cicatrização, transplante de órgãos ou tecidos, insuficiência placentária, es- T 6

treitamento ou oclusão arterial, aterosclerose ou hipertensão sistêmica ou pulmonar.

Outros objetivos a vantagens se tornarão aparentes a partir de uma revisão da seguinte descrição detalhada.

5 Breve Sumário das Figuras

Fig. 1. Deleção genética de um único alelo de DII4 aumentou os números de brotos angiogênicos na vascularização em desenvolvimento da retina. Os números de brotos foram quantificados em 100X campos micros- cópicos. Os resultados foram significantemente diferentes ao nível de p < 0,00001.

Fig. 2. Liberação intra-ocular de DII4-Fc aumentou os números de proliferação de células BrdU-positivas na vascularização em desenvolvi- mento da retina. 4,15 mcg de mDII4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram infetados por via intravítrea em filhotes de camundongo 15 de 7 dias de idade. A vascularização da retina foi analisada 24 horas mais tarde. Os números de células BrdU-positivas foram quantificados em cam- pos de microscópio de 200X. Os significados foram significantemente dife- rentes ao nível de p < 0,05.

Fig. 3A-B. Liberação intra-ocular de DII4-Fc ou anticorpo anti- 20 DII4 promove a rebrotação de vasos da retina em camundongos com retino- patia isquêmica induzida por oxigênio (OIR). (A) 0,48 mcg de mDH4-hFc ou 0,5 mcg de proteína de controle de hFc humano foi injetado por via intraví- trea em filhotes de camundongos OIR de 13 dias de idade (13° dia após o nascimento ou P13). A vascularização da retina foi analisada no P17. (B) 25 2,55 mcg de anticorpo anti-mDII4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P13. A vascularização da retina foi analisada no P17. Áreas avasculares foram me- didas em montagens planas de retina. Os resultados foram significantemen- te diferentes aos níveis de p < 0,0001 (A) e p , 0,05 (B).

Fig. 4A-B. Liberação intra-ocular de DII4-Fc ou anticorpo anti-

DII4 melhora a formação de neovascularização patológica in OIR. (A) 0,48 mcg de mDII4-hFc ou 0,5 mcg de proteína de controle de hFc humano foi injetado por via intravítrea no P13. A vascularização da retina foi analisada no P17. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDII4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P13. A vascularização da retina foi analisada no P17. Áreas vasculares a- 5 normais (áreas contendo “tufos” vasculares ectópicos) foram medidas em montagens planas de retina. Os resultados foram significantemente diferen- tes aos níveis de p < 0,0001 (A) e p < 0,05 (B).

Fig. 5. Liberação intra-ocular de DII4-Fc melhora a perfusão da retina. 0,48 mcg de mDII4-hFc ou 0,5 mcg de proteína de controle de hFc 10 humano foi injetado por via intravítrea no P13. No P17, os animais foram perfundidos com Iecitina de tomate marcada com Texas Red e a vasculari- zação da retina foi analisada no P17. Áreas vasculares não perfundidas fo- ram medidas em montagens planas de retina. Os resultados foram signifi- cantes ao nível de p < 0,0005.

Fig. 6A-B. Liberação intra-ocular de DII4-Fc ou anticorpo anti-

DII4 reduz a hipóxia/isquemia da retina. (A) 4,1 mcg de hDII4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P12. Hypoxyprobe™-1 foi injetado intraperitonealmente uma hora antes de sacrificar os animais. A vascularização da retina foi analisada no P17. As 20 áreas marcadas com Hypoxyprobe foram medidas em montagens planas de retina. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDII4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P13. Hypoxyprobe™-1 foi injetado intraperitonealmente uma hora antes de sacrificar os animais. A vascularização da retina foi analisada no Pl 7. As 25 áreas marcadas com Hypoxyprobe foram medidas em montagens planas de retina. Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,001 (A) e p < 0,05 (B).

Fig. 7. Deleção genética de um único alelo de DII4 reduz a perda de vasos sangüíneos induzida por exposição à hiperoxia. Camundongos de controle DII4+/lacZ e Iittermate WT foram colocados em uma câmara de 75% de oxigênio no P7. A vascularização da retina foi analisada em montagens planas de retina no P12. Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,05.

Fig. 8. Liberação intra-ocular de DIW-Fc ou anticorpo anti-DII4 reduz ou previne a perda de vasos sangüíneos por exposição à hiperoxia. (A) 4,1 mcg de hDII4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano 5 foram injetados por via intravítrea no P8. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio ao P9. A vascularização da retina foi analisada no P10. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDII4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P8. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio no P9. 10 A vascularização da retina foi analisada no P10. Os resultados foram signifi- cantemente diferentes aos níveis de p < 0,00001 (A) e p < 0,0001 (B).

Fig. 9A-B. Liberação intra-ocular de DII4-Fc ou anticorpo anti- DII4 reduz a oclusão de vasos da retina. (A) 4,1 mcg de hDII4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no 15 P8. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio no P9. Os filhotes foram perfundidos com Iecitina fluorescente e a vascularização da retina foi analisada no P10. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDII4 policlo- nal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injeta- dos por via intravítrea no P8. Os filhotes foram colocados em um ambiente 20 de 75% de oxigênio no P9. Os filhotes foram perfundidos com Iecitina fluo- rescente e a vascularização da retina foi analisada no P10. Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,00001 (A) e p <

0,0001 (B).

Fig. 10. Liberação sistêmica de DII4-Fc reduz ou previne a perda 25 de vasos sangüíneos da retina. 4,1 mcg d hDII4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea (ITV) ou hDII4- hFc foi injetado intraperitonealmente a uma dose de 25 mg por kg do peso corporal no P7. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de o- xigênio no P8. A vascularização da retina foi analisada no P9. Os resultados 30 foram significantemente diferentes ao nível de p < 0,0001.

Descrição Detalhada

Antes da descrição dos presentes métodos, deve ser entendido que esta invenção não é limitada aos métodos particulares e condições ex- perimentais descritas, visto que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósi- to de descrever as modalidades particulares apenas, e não tem a intenção 5 de ser limitante, visto que o escopo da presente invenção será limitado ape- nas pelas reivindicações anexas.

A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quais- 10 quer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.

Definições

Pela expressão “antagonista de DII4” deve ser entendido um a- gente capaz de inibir a atividade biológica de DII4 pelo bloqueio da interação de DII4 com seus receptores. A inibição da atividade de DII4 pode ser atra- vés da inibição da ativação do receptor ou com um anticorpo para DII4 ou com um análogo ou fragmento de DII4, o qual liga mas não ativa o receptor (ligação não produtiva). Inibidores comuns incluem, mas não estão limitados a anticorpos, receptores solúveis, aptâmeros oligonucleotídeos, peptídeos ou outros antagonistas de molécula pequena e seus derivados, e Iigandos DII4 modificados que ligam seus receptores Notch, mas não incapazes de ativar a sinalização através de tal ligação. Outras abordagens incluem inter- ferência com a expressão do gene que codifica para DII4 ou bloqueio da ati- vação de receptor Notch, por exemplo, com inibidores de siRNAs ou gama secretase, respectivamente.

O anticorpo “neutralizante” ou “de bloqueio” é destinado a referir a um anticorpo cuja ligação à DII4 resulta na inibição da atividade biológica de DII4. IEsta inibição da atividade biológica de DII4 pode ser avaliada pela 30 medição de um ou mais indicadores da atividade biológica de DII4. Estes indicadores da atividade biológica de DII4 podem ser avaliados por um ou mais de diversos ensaios padrão in vivo ou in vitro conhecidos na técnica (veja exemplos abaixo). Preferencialmente, a capacidade de um anticorpo para neutralizar a atividade de DII4 é avaliada pela inibição da ligação de DII4 a um receptor Notch, tal como Notch 1 e Notch4.

Descrição Geral

5 As vias de sinalização Notch são evolutivamente conservadas e

desempenham um papel-chave na determinação e diferenciação da célula destino em muitos tecidos durante o desenvolvimento embriônico e pós- natal. A maioria dos componentes da via Notch são expressos na vasculari- zação e deleção genética de certos componentes da via Notch, incluindo 10 Notchl, Notch 1/Notch4, Jaggedl, DII1, DII4, Hey1/Hey2 ou presenilinas, re- sulta em Ietalidade embriônica associada com defeitos de remodelagem vascular. Embora muitos destes genes sejam expressos em múltiplos tipos de tecido e célula, DII4 é amplamente restrito ao endotélio vascular, sugerin- do que o DII4 é um ligando-chave para receptores Notch na vascularização. 15 Durante o desenvolvimento embrionário inicial, a deleção genéti-

ca de mesmo um único alelo de DII4 produz severas anormalidades vascula- res que resultam em Ietalidade embriônica na maioria das cepas de camun- dongo. De fato, entre os muitos genes envolvidos na vasculogênese e angi- ogênese, relatou-se que a insuficiência haplóide resulta na maioria dos de- 20 feitos vasculares e Ietalidade embriônica apenas para DII4 e VEGF-A. A Ieta- Iidade embriônica inicial impede a maioria das manipulações experimentais, tornando difícil entender precisamente o papel do DII4 durante o desenvol- vimento vascular e em cenários patológicos.

Para superar esta limitação, os efeitos da deleção do gene DII4 25 foram estudados em camundongos da cepa ICR, na qual a haploinsuficiên- cia produz apenas Ietalidade embriônica limitada. O fenótipo vascular obser- vado nestes camundongos mutantes foi comparado àquele obtido em ca- mundongos do tipo selvagem, nos quais a sinalização DII4/Notch foi seleti- vamente inibida pela injeção por via intravítrea de um inibidor solúvel de DII4, 30 DII4-Fc, ou um anticorpo policlonal neutralizante contra o domínio extracelu- Iar de DII4. Para estes experimentos, a retina foi selecionada como um sis- tema modelo onde estudar a biologia do DII4 porque a vascularização da retina desenvolve-se após o nascimento de uma maneira estereotípica que é altamente organizada, temporal e espacialmente.

O modelo murino de retinopatia isquêmica induzida por oxigênio (OIR) é um modelo bem caracterizado de neovascularização patológica as- 5 sociada com elevada expressão do fator pró-angiogênico essencial, VEGF (Smith et al. 1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 35:101 - 111; Neely et I. 1998 Am J. Pathol 153:665 - 670; Saint-Geniez et al. 2004 Int J Dev Biol 48:1045 - 1058) e, desta forma, relevante para a angiogênese patológica associada com diversas condições de doença (Ferrarra et al. 2005 Nature 438:967 - 10 974). Por fim, a vascularização da retina é prontamente acessível a manipu- lações experimentais, incluindo microinjeções intravítreas de agentes expe- rimentais.

Os experimentos descritos a seguir mostram que durante o de- senvolvimento vascular normal da retina, e no modelo OIR1 a supressão 15 farmacológica da sinalização DII4/Notch aumenta acentuadamente a brota- ção angiogênica e promove a formação de uma rede capilar primária mais densa. Coerentemente, descobriu-se que a expressão de DII4 endógeno é particularmente proeminente nas regiões mais ativas do crescimento vascu- lar tanto durante o desenvolvimento normal quanto no modelo OIR. Além 20 disso, a inibição de DII4 suprimiu acentuadamente a formação da vasculari- zação anormal e preveniu a oclusão e regressão de vasos sangüíneos. Antagonistas de DII4

Os antagonistas de DII4 incluem anticorpos para DII4 e fragmen- tos dos mesmos capazes de bloquear a ligação do DII4 a um receptor Notch, 25 por exemplo, Notchl, e proteínas ou fragmentos de proteína que compreen- dem o domínio extracelular de DII4, o qual pode ser fundido a um componen- te de multímerização; peptídeos e pepticorpos (veja, por exemplo, a publica- ção da patente US 2003/0229023 Oliner et al.).

Anticorpos de DII4.

A expressão “imunoglobulina ou anticorpo”, conforme usada a-

qui, refere-se a um mamífero, incluindo polipeptídeo ou proteína humana que compreende uma região de estrutura a partir de um gene de imunoglo- bulina ou fragmentos dos mesmos que especificamente ligam e reconhecem um antígeno, o qual, no caso da presente invenção, é uma proteína de DII4 ou porção da mesma. Se o destinado anticorpo ou proteína semelhante a anticorpo será utilizado como uma imunoglobulina terapêutica de mamífero, 5 as regiões de ligação devem ser derivadas das imunoglobulinas de mamífe- ro correspondentes. Se a molécula destina-se o uso não terapêutico, tal co- mo para diagnósticos e ELISAs, as regiões de ligação de imunoglobulina devem ser derivadas tanto de mamíferos humanos quanto não humanos, tal como camundongos. Os genes de imunoglobulina humanos ou fragmentos 10 de gene incluem as regiões constantes de cappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e miu, assim como miríade de genes de região variável de imunoglo- bulina. Cadeias leves são classificadas tanto como cappa quanto como lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, um, alfa, delta ou épsilon, os quais por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG1 15 IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de cada classe IgG, existem diferentes isótopos (por exemplo, IgGi, lgG2, etc.) assim como alótipos dos mesmos.

Uma unidade estrutural de imunoglobulina exemplar (anticorpo) de IgG humano compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de 20 dois partes idênticos de cadeias de polipeptídeos, cada par tendo uma ca- deia leve (cerca de 25 kD) e uma cadeia pesada (cerca de 50 - 70 kD). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 - 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis por reconhecimento de antígeno. As expressões “cadeia leve variável” (Vl) e “cadeia pesada variá- 25 vel” (Vh) referem-se àquelas cadeias leves e pesadas, respectivamente.

Os anticorpos existem como imunoglobulinas intactas, ou como um número de fragmentos bem caracterizados produzidos pela digestão com várias peptidases. Por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações dissulfeto na região hinge para produzir F(ab)2, um dímero de 30 Fab que ele próprio é uma cadeia leve unida a Vh - Ch por uma ligação dis- sulfeto. O F(ab)2 pode ser reduzido sob condições amenas à quebra de liga- ções dissulfeto na região hinge, desse modo convertendo o dímero de F(ab)2 em um monômero de Fab’. O monômero de Fab’ é essencialmente Fab com parte da região hinge. Enquanto vários fragmentos de anticorpo são descritos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um versado na técnica irá apreciar que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo tan- 5 to quimicamente quanto pelo uso da metodologia de DNA recombinante. Assim, a expressão anticorpo, conforme utilizada aqui, também inclui frag- mentos de anticorpo tanto produzido pela modificação de anticorpos inteiros quanto aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombi- nante ou gerados por bibliotecas display, tal como phage, bibliotecas display 10 de E. coli ou levedura (veja, por exemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552 - 554).

Fragmentos de análogos de DII4 ou de proteína. O antagonista de DII4 pode ser um fragmento de DII4 opcionalmente conectado a um componente de multimerização. Em modalidades específicas, um fragmento de DII4 pode 15 ser fundido a um componente de multimerização tal como um domínio de imunoglobulina, um domínio truncado de imunoglobulina ou uma seqüência de aminoácido ente 1 a cerca de 500 aminoácidos de comprimento, opcio- nalmente compreendendo pelo menos um resíduo de cisteína. Em uma mo- dalidade preferida, o componente de multimerização é um domínio de imu- 20 noglobulina, preferivelmente um domínio de Fe, por exemplo, um Fc humano (SEQ ID NO:5).A proteína ou fragmento de proteína pode opcionalmente compreender uma seqüência de sinal, o qual pode compreender qualquer seqüência conhecida para um versado na técnica para direcionar a secreção de um polipeptídeo ou proteína a partir de uma célula, incluindo seqüências 25 naturais ou sintéticas. Geralmente, uma seqüência de sinal é colocada no começo ou no terminal amino da proteína de fusão da invenção. Tal seqüên- cia de sinal pode ser nativa à célula, recombinante ou sintética.

O domínio extracelular de DII4 é composto de um domínio Del- ta/Serrate/Lag-2 (DSL) e oito repetições tandem semelhantes ao fator de crescimento epidérmico (EGF). Geralmente, os domínios EGF são reconhe- cidos como ocorrendo em cerca da posição 218 - 251 (domínio 1), 252 - 282 (domínio 2), 284 - 322 (domínio 3), 324 - 360 (domínio 4) e 362 - 400 (domí- nio 5), com o domínio DSL em cerca da posição 173 - 217 e o domínio N- terminal em cerca da posição 27 - 172 de hDII4 (SEQ ID NO:2). Em modali- dades específicas, o antagonista de DII4 compreende cerca da aminoácido 27 - 172, 27 - 217, 218 - 400, 218 - 360, 218 - 322 ou 218 - 282 de SEQ ID 5 NO:2, opcionalmente fundido a hFc (SEQ ID NO:5).

Métodos de Administração

A invenção proporciona métodos de tratamento compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um agente da inven- ção. Em um aspecto preferido, o agente é substancialmente purificado (por 10 exemplo, substancialmente livre de substâncias que limitam seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejáveis). O indivíduo é preferencialmente um animal, por exemplo, uma vaca, porco, cavalo, galinha, gato, cachorro, etc., e é preferencialmente um mamífero, e mais preferencialmente um ser humano. Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar as 15 composições farmacêuticas da invenção localmente na área em necessida- de de tratamento; isto pode ser alcançado, por exemplo, e não por meio de limitação, por infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, por injeção, por meio de um cateter ou por meio de um implante.

Os métodos da invenção podem ser vantajosamente realizados pela administração à área em necessidade de tratamento por administração local, incluindo administração intravítrea, periocular, subconjuntival, justaes- cleral, subtenoniana ou tópica.

Terapias Combinadas

Em várias modalidades, o método da invenção é realizado com 25 um antagonista de DII4, tal como um anticorpo de DII4, em combinação com um ou mais compostos ou terapias ou procedimentos médicos adicionais. Por exemplo, agentes terapêuticos adequados para uso em combinação, tanto alternada quanto simultaneamente, incluem proteínas de fusão capa- zes de ligar e inibir a atividade do fator de crescimento endotelial vascular 30 (VEGF) (veja patentes US 7,070,959 e US 7,087,411), agentes imunossu- pressores tais como corticosteróides, dexametasona, ciclosporina A, FK506 ou agentes antimetabólicos (veja Barker, NH, et al., (2000) CLin Exp Opthal 28:357 - 360). Outros agentes terapêuticos adequados para uso em combi- nação, tanto alternado quanto simultaneamente, com os antagonistas de DII4 da invenção podem incluir agentes que podem bloquear a atividade bio- lógica de outros membros da família do VEGF, tais como VEGF-C e VEGF- 5 D.

Exemplos

Os exemplos a seguir são apresentados de modo a proporcionar àqueles versados na técnica com uma divulgação e descrição completas de como fazer e usar os métodos e composições da invenção, e não se desti- 10 nam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Foram feitos esforços para assegurar a exatidão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, medições de área, etc.), mas alguns er- ros e desvios experimentais devem ser considerados.

Exemplo 1. Efeito da deleção genética de um único alelo de DII4 na brotação de vasos sangüíneos na vascularização em desenvolvimento da retina.

Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da defici- ência genética parcial de DII4 na brotação de vasos sangüíneos durante o desenvolvimento normal da angiogênese da retina.

Animais. Tecnologia Velocigene™ (Valenzuela et al. (2003) Nat.

Biotechnol. 21:652 - 9; patente US 6,586,251) foi usada para substituir toda a região codificadora de DII4 com o gene repórter da β-galactosidase em células estaminais embrionárias de camundongo híbrido C57BL/6:129. Ma- chos quiméricos foram criados para fêmeas ICR. Retrocruzamentos de ca- 25 mundongos DII4+/lacZ por 3 gerações a ICR (87,5% de ICR) foram usados para este estudo.

Histoquímica e imunocoloracão. Filhotes de camundongo foram humanamente eutanizados no P7. Os olhos foram enucleados e as retinas foram dissecadas, fixas durante a noite com paraformaldeído 4%, tingidas 30 com Iecitina I de Griffonia simplicifolia (GS) marcada com FITC (Vector Labo- ratories, Burlingame, CA), e examinadas em montagens planas. As imagens foram tomadas usando um microscópio Nikon (Melville, NY). Quantificações. Medições foram realizadas usando o software Scion Image. Cada condição experimental foi ensaiada pelo menos três ve- zes. Teste t de Student e análise de variância Two-way foram usados para avaliar a significância estatística.

5 Resultados. Plexo periférico foi muito mais denso em camun-

dongos DII4+/lacZ do que em Iittermates do tipo selvagem. Visualizações de alta energia evidenciaram que o plexo periférico mais denso nas retinas de camundongos DII4+/lacZ consistia em capilares que eram mais largos em diâ- metro, mais altamente interconectados e hiper-fundidos de modo que em 10 algumas áreas os vasos aglutinaram para formar um sincício e, além disso, que havia muito mais brotos na frente crescente (Fig. 1); filopodia também foi observada em porções mais interiores do plexo em uma freqüência mais alta do que a freqüência normal. Análises quantitativas revelaram que, com- paradas aos controles do tipo selvagem, as retinas dos camundongos 15 DII4+/lacZ mostraram um aumento de 68% no número de brotos na frente crescente da vascularização superficial da retina (Fig. 1), assim como um aumento maior do que duas vezes no número de interconexões capilares por unidade de área, resultando em um aumento significante na cobertura vascular. Apesar das acentuadas mudanças morfológicas, injeção intravas- 20 cular de Iecitina fluoresceinada preencheu completamente o plexo vascular superficial em desenvolvimento, exceto pela filopodia que se alargou a partir das células da ponta, em camundongos DII4+/lacZ como em camundongos do tipo selvagem, indicando que todos os componentes da vascularização em desenvolvimento tinha lúmens e eram funcionais.

Exemplo 2. Efeito da inibição de DII4/Notch com DII4-Fc ou anti-

corpo anti-DII4 sobre a vascularização em desenvolvimento da retina.

Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da inibição farmacológica da sinalização DII4/Notch sobre a proliferação de células en- doteliais e a brotação de vasos sangüíneos durante o desenvolvimento nor- mal da angiogênese da retina.

Anticorpos e reaaentes. DII4-Fc compreende um domínio extra- celular de DII4 humano ou de camundongo e parte do Fe IgG humano. DII4- Fe foi expresso em céiulas CHO e a afinidade purificada por cromatografia de proteína A. O anticorpo anti-DII4 foi produzido por imunização de coelhos com mDII4-hFc recombinante. O anti-soro foi parcialmente purificado por cromatografia de proteína A antes do uso.

5 Animais. Camundongos C57/BI6 (Taconic) foram usados para

estudar o efeito DII4-Fc ou anticorpo de DII4 neutralizante na vascularização em desenvolvimento da retina.

Micro-iniecões intravítreas. Micro-injeções intravítreas (30 - 100 nl) dos compostos de pesquisa foram feitas entre o equador e o limbo da córnea usando um nano injetor Drummond Scientific (BroPA) equipado com uma agulha de vidro.

Marcação com BrdU. Células proliferantes foram marcadas com a administração de BrdU (1 mg/kg i.p.) 20 horas após injeção intravítrea de hFc ou DII4-Fc. As retinas foram colhidas 4 horas mais tarde e tingidas com anticorpos ant-BrdU (Dako North América, Inc., Carpinteria, CA) e VE- Cadherin (BD PharMingen, São Diego, CA).

Resultados. Para estudar o efeito da deficiência local intra-retinal na sinalização DII4/Notch, e não secundária a uma anormalidade sistêmica não detectada, uma versão solúvel de DII4 (denominada DII4-Fc), que liga 20 receptores Notch sem ativá-los, assim bloqueando as ações do DII4 endó- geno, ou um anticorpo policlonal de neutralizante específico para o domínio extracelular de DII4 foi injetado no vítreo de camundongos do tipo selvagem. Três dias após a administração intra-ocular de cada bloqueador de DII4, os vasos da retina exibiram mudanças morfológicas que se assemelham estrei- 25 tamente às anormalidades vasculares encontradas em camundongos DII4+/lacZ, incluindo densidade de vasos sangüíneos e calibre de vasos dra- maticamente aumentados. Além disso, estas mudanças morfológicas carac- terísticas ocorreram rapidamente, sendo claramente evidentes dentro de 24 horas.

A marcação com BrdU também mostrou um aumento na prolife-

ração de células epiteliais dentro de 24 horas do bloqueio de DII4 (Fig. 2). O aumento observado de -17% na taxa de proliferação poderia render mais do que 50% de aumento no número de células dentro de três a quatro tempos de duplicação.

Exemplo 3. Efeito do anticorpo de DII4 e anti-DII4 sobre a vascu- larização, perfusão e anormalidades vasculares da retina em camundongos 5 com OlFl.

Uma investigação foi feita para determinar os efeitos do anticor- po de DII4 e anti-DII4 sobre o crescimento de vasos da retina, formação de anormalidades vasculares e perfusão da retina em retinopatia isquêmica in- duzida por oxigênio (OIR).

Para determinar se a sinalização DII4/Notch desempenha um

papel na angiogênese patológica assim como durante o desenvolvimento normal, o modelo de OIR foi utilizado. No modelo de OIR, a exposição dos filhotes de camundongo à hiperóxia no P7 resulta em uma rápida obstrução de capilares na retina central. Após retorno ao ar ambiente no P12, a zona 15 avascular tornou-se severamente hipóxia, o que por sua vez produz extensa neovascularização anormal, caracterizada pelo crescimento ectópico de va- sos no vítreo (“tufos” vasculares epirretinais) e a formação de derivações arteriovenosas anormais; partes centrais da retina permanecem amplamente avasculares por um período prolongado.

Animais e modelo OIR. Camundongos C57/BI6 (Taconic) foram

usados para estudar o efeito do DII4-Fc ou anticorpo neutralizante de DII4 sobre a neovascularização da retina em OIR. OIR foi produzido seguindo o método desenvolvido por Smith et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 1994, 35:101 - 111). Em resumo, os filhotes de camundongo e seus(suas) “dams” 25 foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio a partir do dia (P) 7 ao P12 após o nascimento, e então retornados ao ar ambiente. A exposição a hiperóxia induz à rápida obstrução dos vasos na retina central. Quando os camundongos são retornados ao ar ambiente (P12), a perda de vasos da retina central resulta em severa hipóxia/isquemia, o que por sua vez estimula 30 as mudanças vasculares patológicas descritas acima.

Para marcar vasos sangüíneos patentes, 50 ml de Iecitina de Lycopersicon esculentum (LE) marcada de vermelho (1 mg/ml; Vector Labo- ratorios, CA) foram injetados no ventrículo cardíaco esquerdo e deixados circular por 5 minutos.

Resultados. A inibição de DII4/Notch com DII4*Fc ou anticorpo anti-DII4 melhorou a neovascularização patológica (Fig. 3A-B), estimulou o 5 crescimento de novos vasos sangüíneos (Fig. 4A-B) e aumentou a re- perfusão da retina (Fig. 5).

DII4-Fc ou anticorpo anti-DII4 ou uma proteína de controle (hFc) foi injetado por via intravítrea no P13, um dia depois os animais foram retor- nados ao ar ambiente, bem após a obstrução dos vasos foi completa.

Quando as retinas foram avaliadas no P17, a administração de

DII4-Fc ou anticorpo anti-DII4 suprimiu dramaticamente o crescimento ectó- pico de tufos neovasculares patológicos no vítreo (Fig. 1), e também preve- niu a formação de derivações arteriovenosas anormais. As áreas ocupadas pelos tufos neovasculares foram reduzidas em 43% nas retinas tratadas com 15 DII4-Fc e em 85% nas retinas tratadas com anticorpo anti-DII4, ambos em comparação às retinas de controle tratadas com hFc .

Além disso, foi verificado que DII4-FC e anticorpo anti-DII4 esti- mulam mais brotações extensivas de novos vasos a partir de capilares e veias no entorno da zona avascular, resultando em um re-crescimento mais rápido de vasos sangüíneos na retina central, onde a vascularização tinha sido esgotada, desse modo reduzindo a área avascular da retina (Fig. 4A-B). As áreas avasculares foram reduzidas em 43% nas retinas tratadas com DII4-Fc e em 63% nas retinas tratadas com anticorpo anti-DII4. Particular- mente, foi notável o re-crescimento capilar extensivo emanando das veias na zona avascular das retinas tratadas com DII4-Fc. Assim, a atenuação da si- nalização DII4/Notch favoreceu a extensão de novas brotações vasculares ao longo da superfície da retina, e obtundiu a formação de neovasculariza- ção epirretinal, resultando em uma reformação mais rápida do plexo vascular superficial. Os vasos recém-formados eram funcionais e exibiram reperfusão aumentada da retina, como evidente pela redução de 45% de áreas não per- fundidas nas retinas tratadas com DII4-Fc (Fig. 5).

Exemplo 4. Efeito de DII4-Fc e anticorpo anti-DII4 sobre hipóxia/isquemia da retina no modelo OIR.

Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da DII4-Fc e anticorpo anti-DII4 sobre a hipóxia/isquemia da retina no modelo OIR de neovascularização patológica.

Crescimento excessivo de vasos sangüíneos sob certas circuns-

tâncias pode interferir com a circulação normal do sangue e reduzir a oxige- nação do tecido. Para testar se a inibição de DII4/Notch pode aumentar a oxigenação do tecido, HYPOXYPROBE™'1 (Chemicon) foi usado em um ensaio não invasivo para detectar a hipóxia do tecido e determinar o efeito 10 do tratamento de DII4-Fc sobre a hipóxia/isquemia da retina. HYPOXYPRO- BE™'1 foi injetado intraperitonealmente a 100 mg/kg uma hora antes da cole- ta das retinas para avaliação.

Resultados. O crescimento de novos vasos funcionais seguindo administração por via intravítrea de inibidores de DII4/Notch reduziu eficaz- mente a hipóxia/isquemia do tecido como evidente em 69% e redução de 30% de áreas hypoxyprobe positivas em retinas tratadas com DII4-Fc e anti- corpo anti-DII4, respectivamente (Fig. 6A-B).

Exemplo 5. Deleção genética de um único alelo de DII4 reduz a obstrução de vasos induzida por hiperóxia.

Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da defici-

ência genética parcial de DII4 sobre a regressão de vasos sangüíneos indu- zida por hiperóxia.

Animais. Retrocruzamentos de camundongos DII4+/lacZ por três gerações a ICR (87,5% de ICR) foram gerados, conforme descrito acima. 25 Devido a uma mutação recessiva (rd/rd), a camada de célula fotorreceptora da retina começa a degenerar-se no P12 em camundongos ICR. Desse mo- do, para livrar-se de efeitos secundários potenciais de perda fotorreceptora na vascularização da retina, para avaliar estágios posteriores do desenvol- vimento da retina e para todos experimentos OIR, camundongos DII4+/lacZ 30 (87,5% de ICR) foram retrocruzados C57BL76 para produzir camundongos Rd/rd,o qual não exibe degeneração fotorreceptora.

Os filhotes de camundongo foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio a partir do dia (P) 7 ao P12 após o nascimento. As retinas foram colhidas e a vascularização da retina foi analisada em montagens pla- nas.

Resultados. A expressão reduzida de DII4 na vascularização da retina de camundongos DII4+/lacZ previne parcialmente a perda de vasos san- güíneos da retina induzida por hiperóxia (Fig. 7). No modelo OIR, a exposi- ção dos filhotes de camundongo à hiperóxia no P7 resultou em uma rápida oclusão e obstrução de capilares na retina central. Para determinar se a ini- bição de DII4/Notch pode ter um efeito protetor sobre os vasos sangüíneos, o efeito da deficiência genética parcial de DII4 em camundongos DII4+/lacZ sobre a obstrução de vasos induzida por hiperóxia foi analisado. Avaliando os animais no P12 (de modo a avaliar a medida da obstrução hiperóxica de vasos), verificou-se que a obstrução de vasos foi reduzida em 40% em ca- mundongos DII4+/lacZ em comparação aos animais de controle Iittermate do tipo selvagem, sugerindo que os inibidores de DII4 podem proteger os vasos sangüíneos existentes de regressão.

Exemplo 6. Efeitos de DII4-Fc e anticorpo anti-DII4 sobre a obstrução de va- sos induzida por hiperóxia.

Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da inibição de DII4/Notch com DII4-Fc e anticorpo anti-DII4 sobre a regressão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia.

Animais. Camundongos C57/BI6 (Taconic) foram usados para estudar o efeito do DII4 ou anticorpo neutralizante de DII4 sobre a obstrução de vasos sangüíneos da retina induzida por oxigênio. Microinjeções intraví- 25 treas dos compostos de pesquisa foram realizadas no dia 8 após o nasci- mento. No dia 9 após o nascimento, os filhotes foram colocados em um am- biente de 75% de oxigênio. As retinas foram colhidas 24 horas mais tarde e vascularização da retina foi analisada em montagens planas.

Resultados. Injeção intravítrea de DII4-Fc ou anticorpo anti-DII4 reduziu dramaticamente as áreas de vascularização obstruída em 97% e 41%, respectivamente (Fig. 8A-B).

Exemplo 7. Efeitos do DII4-Fc e anticorpo anti-DII4 sobre a oclusão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia.

Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da inibição de DII4/Notch com DII4-Fc e anticorpo anti-DII4 sobre a oclusão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia. Todos os procedimentos foram realiza- dos conforme descrito acima.

O tratamento de DII4-Fc e anticorpo anti-DII4 reduziu as áreas não perfundidas da retina em 40% e 29%, respectivamente (Fig. 9A-B). Exemplo 8. Efeitos da administração sistêmica de DII4-Fc sobre a regressão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia.

Uma investigação foi feita para determinar os efeitos do trata-

mento sistêmico com DII4-Fc sobre a regressão de vasos sangüíneos indu- zida por hiperóxia.

4.1 mcg de hDII4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea (ITV) ou hDII4-hFc foi injetado 15 intraperitonealmente a uma dose de 25 mg por kg do peso corporal no P7. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio no P8 e a vascularização da retina foi analisada no P9. Todos os outros procedimentos foram realizados conforme descrito acima;

Resultados. Tanto administração local (intravítrea) quanto sistê- mica (intraperitoneal) de DII4-Fc reduziu as áreas de vascularização obstruí- da em 86% e 56%, respectivamente, indicando que independentemente da via de administração, os inibidores de= DII4 podem ser eficazmente usados para proteger os vasos sangüíneos de regressão (Fig. 10).

Claims (7)

1. Uso de um agente capaz de inibir a atividade de DII4 na fabri- cação de um medicamento para tratar, inibir ou melhorar um distúrbio is- quêmico ou vascular, em que o antagonista de DII4 compreende um anticor- po ou fragmento de anticorpo capaz de bloquear a ligação do DII4 a um re- ceptor Notch ou compreende um fragmento de DII4, opcionalmente conecta- do a um componente de multimerização.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo de DII4 ou fragmento de anticorpo é policlonal ou monoclonal.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é humanizado, quimérico ou é um anticorpo ou frag- mento de anticorpo plenamente humano.

4. Uso, de acordo com qualquer um das reivindicações de 1 a 3, em que o distúrbio isquêmico ou vascular é uma doença ou condição do olho caracterizada pela presença de vasos sangüíneos anormais e/ou perda de vasos sangüíneos normais ou função de vasos.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, em que a doença do olho é retinopatia da prematuridade, retinopatia isquêmica, oclusão da arté- ria ou veia da retina, retinopatia diabética, neovascularização coroidéia, de- generação macular relacionada à idade, neovascularização da córnea, glau- coma neovascular ou transplante da córnea.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a5, em que o indivíduo tratado é um ser humano.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a3, em que o distúrbio isquêmico ou vascular é lesão isquêmica, isquemia cerebral, isquemia cardíaca, condições isquêmicas que afetam os limbos e outros órgãos e tecidos, más formações arteriovenosas, cicatrização, trans- plante de órgãos e tecidos, insuficiência placentária, estreitamento e oclusão arterial, aterosclerose e hipertensão sistêmica ou pulmonar.