BR112020013771A2 - produto de leite fermentado e preparação deste utilizando fosfolipase - Google Patents
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Abstract
A presente invenção está no campo da tecnologia de laticínios. Refere-se a métodos para produzir produtos de leite fermentado, caracterizados pelo fato de que pelo menos uma fosfolipase é usada para tratar a base leiteira no processo de fermentação. A invenção também provê um produto de leite fermentado produzido a partir dele e um kit contendo uma cultura iniciadora e uma fosfolipase.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- DUTO DE LEITE FERMENTADO E PREPARAÇÃO DESTE UTILI- ZANDO FOSFOLIPASE".
[001] A presente invenção refere-se geralmente a processos para produzir produtos de leite fermentado.
[002] Produtos de leite, tais como produtos de leite fermentado são conhecidos na técnica. Textura é um parâmetro de qualidade mui- to importante para produtos de leite fermentado. Uma consistência su- ave, com bom paladar e firmeza de gel é desejada por muitos consu- midores.
[003] A adição de proteínas, tipicamente leite em pó desnatado ou proteínas à base de soro, é um procedimento padrão para melhorar a textura de produtos de leite fermentado. Espessantes ou outros agentes texturizantes como amido modificado, amido de milho, pecti- na, gelatina ou ágar, são frequentemente usados. No entanto, adicio- nar proteínas ou agentes texturizantes pode ser caro. Assim, é vanta- joso prover um processo para produzir um produto de leite fermentado, no qual a adição desses agentes possa ser reduzida ou eliminada. Is- so é desejável, pois há uma crescente demanda de mercado por pro- dutos de leite fermentado com um "rótulo limpo", ou seja, sem adição de agentes estabilizadores ou texturizantes.
[004] A homogeneização é outro procedimento comum para dar uma boa textura aos produtos de leite fermentado. É realizada antes da fermentação para quebrar a gordura do leite em tamanhos meno- res. Os glóbulos de gordura menores criados neste processo podem ser facilmente suspensos em solução, assim que não exista como uma camada separada do leite. A homogeneização pode ser realizada, por exemplo, forçando o leite através de um filtro fino ou válvula restritiva em altas pressões, com isso formando uma emulsão com tamanho de partícula reduzido. A pressão de homogeneização normalmente apli- cada na indústria leiteira é de cerca de 150 a 250 bar, dependendo do produto. No entanto, a homogeneização é cara, pois requer um grande gasto de energia. Portanto, seria vantajoso proporcionar um processo no qual a necessidade de homogeneização seja reduzida, reduzindo assim os custos de operação para o fabricante.
[005] Foram feitas tentativas para resolver essa questão. Muitos delas referem-se a prover novas cepas de bactérias de ácido lático que podem resultar em melhor textura. Por exemplo, WO2007/095958A1 (Chr. Hansen) descreve o uso de certas culturas iniciadoras que produzem polissacarídeos extracelulares, para melho- rar a textura de produtos de leite fermentado. Permanece uma neces- sidade constante na técnica, de melhorar as propriedades sensoriais dos produtos de leite fermentado, especialmente paladar e revestimen- to bucal dos produtos.
[006] A presente invenção baseia-se, em parte, na surpreendente descoberta de que fosfolipases têm efeitos positivos sobre as qualida- des sensoriais dos produtos de leite fermentado. Utilizando fosfoli- pase(s) no processo de preparação, é possível reduzir ou mesmo eli- minar o uso de proteínas, agentes texturizantes ou agentes estabili- zantes nos produtos de leite fermentado. Também é possível reduzir o custo de homogeneização requerido no processo de fabricação.
[007] A presente invenção provê um novo uso de fosfolipase em um processo para preparar um produto de leite fermentado. O produto de leite fermentado, tal como iogurte, pode ser produzido a partir da base de leite que foi padronizada em relação ao teor de gordura e pro- teína, homogeneizada e tratada com calor. Depois, o leite é inoculado com uma cultura iniciadora e fermentado.
[008] Observou-se que a fosfolipase pode participar ativamente do processo de fermentação por bactérias de ácido lático, resultando em um aumento na viscosidade do produto fermentado final. A presen- te invenção assim provê um processo para produzir um produto de lei- te fermentado no qual uma base de leite contendo fosfolipase é fer- mentada.
[009] O presente pedido provê um processo compreendendo adi- cionar uma cultura iniciadora a uma base de leite, fermentando a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado, em que pelo menos uma fosfolipase é adicionada à base de leite. A fosfolipase pode ser adicionada antes, no início ou durante a fermen- tação. Preferivelmente, a fosfolipase é adicionada antes ou no início da fermentação. Depois que um pH alvo seja alcançado, um produto de leite fermentado pode ser obtido.
[0010] O presente pedido provê um processo para produzir um produto de leite fermentado compreendendo as etapas de: a) adicionar uma cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa de bactérias de ácido lático a uma base de leite, b) fermentar a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado, e c) adicionar pelo menos uma fosfolipase à base de leite antes, no início ou durante o período de fermentação.
[0011] A fosfolipase, que pode ser usada para o presente pedido, inclui fosfolipase A, tal como fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) e fosfolipase A2 (EC 3.1.1.1.24), e fosfolipase B (EC 3.1.1.5), fosfolipase C (EC
3.1.4.3) e fosfolipase D (EC 3.1.4.4).
[0012] Incluído no presente pedido está um produto de leite fer- mentado obtido pelos processos aqui descritos. Em outro aspecto, a presente invenção provê um produto de leite fermentado compreen- dendo fosfolipase.
[0013] Em outro aspecto, a presente invenção provê um kit com- preendendo uma cultura iniciadora e pelo menos uma fosfolipase útil para a fabricação de produtos de leite fermentado.
[0014] Outras características e vantagens da invenção se tornarão evidentes a partir da leitura da seguinte descrição, em conjunto com as figuras que acompanham.
[0015] A Figura 1 retrata a curva de histerese de produtos de leite fermentado preparados no exemplo 1, mostrando tensão de cisalha- mento em função das taxas de cisalhamento.
[0016] A Figura 2 retrata efeitos de fator na variável de resposta (viscosidade a 60 1/s) em produtos de leite fermentado preparados no exemplo 2.
[0017] A Figura 3 retrata efeitos de fator na variável de resposta (viscosidade a 300 1/s) em produtos de leite fermentado preparados no exemplo 2.
[0018] A Figura 4 retrata a curva de histerese de produtos de leite fermentado preparados no exemplo 3, mostrando tensão de cisalha- mento em função das taxas de cisalhamento.
[0019] Esta invenção refere-se a produtos de leite fermentado pro- duzidos pela fermentação do leite com microrganismos selecionados. Os leites fermentados podem ser caracterizados por culturas iniciado- ras específicas utilizadas na fermentação. Por exemplo, culturas sim- bióticas de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, são usados como cultura iniciadora para iogurte, enquanto Lactobacillus acidphilus é usado para fazer leite acidófilo. Outras bactérias de ácido de ácido lático mesofílicas são usadas para produzir coalhada ou queijo fresco.
[0020] Para preparar os produtos de acordo com o presente pedi-
do, uma base de leite é inicialmente provida como material iniciador. A "base de leite" é amplamente utilizada no presente pedido para se re- ferir a uma composição baseada em leite ou componentes de leite que podem ser usados como meio de crescimento e fermentação de uma cultura iniciadora. "Leite" geralmente se refere à secreção láctea obtida pela ordenha de qualquer mamífero, como vacas, ovelhas, cabras, bú- falas ou camelas. A base de leite pode ser obtida de qualquer material de leite cru e/ou processado, bem como de leite em pó reconstituído. A base de leite também pode ser baseada em plantas, ou seja, prepara- da a partir de material de plantas, por exemplo, leite de soja.
[0021] Bases de leite utilizáveis incluem, mas não se limitam a, soluções/suspensões de qualquer leite ou produtos similares a leite compreendendo proteínas, tais como leite integral ou com baixa gordu- ra, leite desnatado, leite de manteiga, leite em pó reconstituído, leite condensado, leite seco.
[0022] Nos métodos e produtos da presente invenção, é preferida a base de leite preparada a partir de leite ou componentes de leite de vacas.
[0023] A base de leite também pode ser de lactose reduzida, de- pendendo da necessidade dos consumidores. O leite de teor reduzido de lactose pode ser produzido de acordo com qualquer método conhe- cido na técnica, incluindo hidrolisar a lactose, por enzima lactase, à glicose e galactose, ou por nanofiltração, eletrodiálise, cromatografia de troca iônica e centrifugação. Pasteurização
[0024] A base de leite é preferivelmente pasteurizada antes da fermentação, de acordo com métodos conhecidos na técnica. "Pasteu- rização" tal como aqui usado, significa o tratamento da base de leite para reduzir ou eliminar a presença de organismos vivos, tais como microrganismos. Preferivelmente, a pasteurização é obtida mantendo uma temperatura especificada por um período de tempo especificado. A temperatura especificada é geralmente obtida por aquecimento. Aqueles versados na técnica comum são capazes de selecionar tem- peratura e duração para matar ou inativar certos microrganismos. Uma etapa resfriamento rápido pode seguir. Homogeneização
[0025] "Homogeneizar" refere-se ao processo de homogeneizar de uma mistura para obter uma composição líquida uniforme, a partir de componentes não miscíveis. O processo de homogeneização quebra a gordura do leite em partículas de tamanho menor, assim que não se separe mais do leite. Isso pode ser feito forçando o leite em alta pres- são através de pequenos orifícios. A homogeneização é normalmente aplicada na indústria leiteira após ou ao mesmo tempo que a pasteuri- zação. Como ficará evidente na descrição a seguir, a presente inven- ção provê processos em que a necessidade de homogeneização é re- duzida. Assim, em algumas configurações, a base de leite é homoge- neizada a uma pressão menor do que normalmente exigida, e em ou- tras configurações, a base leiteira não é homogeneizada. Fermentação
[0026] Para fermentar a base de leite é adicionada uma cultura iniciadora. O termo "iniciador" ou "cultura iniciadora" como usado no contexto atual, refere-se a uma cultura de um ou mais microrganismos de grau alimentar, especialmente bactérias de ácido lático, que são responsáveis pela acidificação da base de leite. As culturas iniciadoras podem ser frescas, congeladas ou secas-congeladas. Está dentro das habilidades dos praticantes comuns, determinar a cultura iniciadora e as quantidades a serem usadas.
[0027] "Fermentação" geralmente significa a conversão de carboi- dratos em álcoois ou ácidos, através da ação de um microrganismo. Na presente invenção, a fermentação nos métodos da invenção refere-
se à conversão da lactose em ácido de ácido lático. Cultura iniciadora
[0028] De acordo com a presente invenção, a cultura iniciadora compreende pelo menos uma cepa de bactérias de ácido lático. As bactérias de ácido lático são amplamente utilizadas para a produção de alimentos fermentados e seu uso é bem conhecido na técnica. No contexto da presente aplicação, o termo "bactérias de ácido lático" ou "LAB" é usado para se referir a bactérias de grau alimentar que produ- zem ácido de ácido lático como o principal produto final metabólico da fermentação de carboidratos. Essas bactérias estão relacionadas por suas características metabólicas e fisiológicas comuns e geralmente são gram-positivas, de baixo GC, tolerantes a ácido, não-esporuladas, anaeróbicas, bacilos ou cocos em forma de bastonetes. Durante a etapa de fermentação, o consumo de lactose por essas bactérias cau- sa a formação de ácido de ácido lático, reduzindo o pH e levando à formação de um coágulo de proteína.
[0029] Uma cultura iniciadora útil para a presente invenção pode ter a composição da cepa de qualquer cultura iniciadora convencional de bactérias de ácido lático, incluindo cultura de cepa única ou mistu- ras de culturas, dependendo do tipo específico de produto de leite fer- mentado. Outras bactérias úteis, incluindo a bactéria probiótica Bifido- bacterium spp, também podem ser incluídas na fermentação, além da cultura iniciadora.
[0030] Em uma modalidade, a cultura iniciadora compreende bac- térias termofílicas para produzir produto de leite fermentado termofí- lico. O termo "produto de leite fermentado termofílico" refere-se a pro- dutos de leite fermentados preparados pela fermentação termofílica de uma cultura iniciadora termofílica e exemplos incluem produtos de leite fermentados, tais como iogurte, iogurte batido e iogurte de beber, por exemplo, Yakult. Industrialmente, as bactérias termofílicas mais úteis
("termófilos") incluem Streptococcus spp. e Lactobacillus spp. O termo "fermentação termofílica" aqui refere-se à fermentação a uma tempera- tura acima de cerca de 35°C,tal como entre cerca de 35°C e cerca de 45°C. "Termófilos" são geralmente microrganismos que prosperam melhor a temperaturas acima de 35°C.
[0031] Em outra modalidade, a cultura iniciadora compreende bac- térias mesofílicas para produzir produto de leite fermentado mesofílico. O termo "produto de leite fermentado mesofílico" refere-se a produtos de leite fermentado preparados pela fermentação mesofílica de uma cultura iniciadora mesofílica e exemplos incluem produtos de leite fer- mentado, tais como leite de manteiga, leite coalhado, leite cultivado, smetana, creme de leite, kefir e queijo fresco, tal como quark, tvarog e cream cheese. Bactérias mesofílicas úteis ("mesófilos") incluem Lacto- coccus spp. e Leuconostoc spp. O termo "fermentação mesofílica" aqui refere-se à fermentação a uma temperatura entre cerca de 22°C e cer- ca de 37°C. O termo "mesófilos" geralmente se refere a microrganis- mos que prosperam melhor a temperaturas moderadas (15°C-35°C).
[0032] Bactérias de ácido lático úteis para fazer produto de leite fermentado abrangem, mas não se limitam a, bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., tal como Lactobacillus delbrueckii subsp. bul- garicus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacte- rium animalis, Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei, Lactobaci- llus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lac- tobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve e Leuconostoc spp. A seleção específica de cepas na cultura iniciado- ra dependerá no tipo particular do lacticínio fermentado a ser fabrica- do.
[0033] Em uma modalidade preferida, a cultura iniciadora contém pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus.
[0034] Em uma modalidade preferida, as bactérias lácteas são se- lecionadas a partir do grupo consistindo em bactérias dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus e Leuconostoc.
[0035] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado é um produto obtido usando uma ou mais bactérias lácteas selecionadas do grupo consistindo em Streptococcus ther- mophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Processo de fermentação
[0036] Depois de adicionar a cultura iniciadora e submeter a base de leite a uma condição adequada, o processo de fermentação come- ça e continua por um período de tempo. Uma pessoa de habilidade comum na técnica sabe como selecionar condições adequadas de processo, tais como temperatura, oxigênio, adição de carboidratos, quantidade e características de microrganismo(s) e o tempo de pro- cesso que leva. Esse processo pode levar de três, quatro, cinco, seis horas ou mais.
[0037] Estas condições incluem o ajuste de uma temperatura que é adequada para as cepas de cultura iniciadora particulares. Por exemplo, quando a cultura iniciadora compreende bactérias láticas mesofílicas, a temperatura pode ser ajustada para cerca de 30°C, e se a cultura compreende cepas de bacterianas lácteas termofílicas, a temperatura é mantida na faixa de cerca de 35°C a 50°C, tal como 40°C a 45°C. O ajuste da temperatura de fermentação também de- pende da(s) enzima(s) adicionada à fermentação, que pode ser pron- tamente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técni- ca. Em uma modalidade particular da invenção, a temperatura de fer- mentação é entre 35°C e 45°C, preferivelmente entre 37°C e 43°C, e mais preferivelmente entre 40°C e 43°C.
[0038] A fermentação pode ser encerrada usando quaisquer mé-
todos conhecidos na técnica. Geralmente, dependendo de vários pa- râmetros do processo, a fermentação pode ser encerrada tornando a base de leite inadequada para que a cepa da cultura iniciadora cresça. Por exemplo, o término pode ser realizado por meio de resfriamento rápido do produto de leite fermentado quando um pH alvo é alcançado. Sabe-se que durante a fermentação ocorre acidificação, o que leva à formação de uma rede tridimensional consistindo em cluster e cadeias de caseínas. O termo "pH alvo" significa o pH no qual termina a etapa de fermentação. O pH alvo depende do produto de leite fermentado a ser obtido e pode ser prontamente determinado por uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[0039] Em uma modalidade particular da invenção, a fermentação é realizada até que um pH de 5.0 seja atingido, incluindo até um pH de 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8 ou 3,7. Preferivel- mente, a fermentação é realizada até que um pH alvo entre 4,0 e 5,0 e mais preferivelmente entre 4.0 e 4.6 seja atingido. Em uma modalida- de preferida, a fermentação é realizada até que o pH alvo abaixo de 4,6 seja atingido. Fosfolipase
[0040] O leite contém fosfolipídios. Os fosfolipídios estão associa- dos com a gordura do leite devido às suas propriedades lipofílicas, apolares. Fosfolipídios, tais como lecitina ou fosfatidilcolina, consistem de glicerol esterificado com dois ácidos graxos em posições externas (sn-1) e média (sn-2) e esterificadas com ácido fosfórico na terceira posição. O ácido fosfórico, por sua vez, pode ser esterificado para um amino-álcool. Fosfolipídios podem ser hidrolisados por fosfolipase em lisofosfolipídio, que por sua vez podem ser hidrolisados por uma liso- fosfolipase.
[0041] Fosfolipases são enzimas fundamentais que desempenham um papel crucial em organismos vivos em geral e no metabolismo e biossíntese de fosfolipídios em particular. As enzimas participam da hidrólise dos fosfolipídios e vários tipos de atividade fosfolipase podem ser distinguidas. A fosfolipase A pode ainda ser classificada como fos- folipase A1 (EC 3.1.32) ou A2 (EC 3.1.1.4.), que hidrolisam um grupo acila graxo (na posição sn-1 e sn-2, respectivamente) para formar liso- fosfolipídio. A fosfolipase B (EC 3.1.1.5) hidrolisa o grupo acila graxo restante em lisofosfolipídio. Outros fosfolipases são fosfolipase C (EC
3.1.4.3) e fosfolipase D (EC 3.1.4.4). Uma fosfolipase a ser usada no método da invenção pode ser qualquer fosfolipase ou qualquer combi- nação de fosfolipases.
[0042] Em uma modalidade preferida, a(s) fosfolipase(s) útil para o presente pedido é fosfolipase A. Mais preferivelmente, a fosfolipase é fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) e/ou fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4). Em ou- tras configurações, a fosfolipase é fosfolipase B (EC 3.1.1.5) ou C (EC
3.1.4.3).
[0043] A fosfolipase A1 é definida de acordo com a classificação europeia (EC) de enzima padrão como EC 3.1.1.32. Nome Oficial: Fosfolipase A1 Reação catalisada: fosfatidilcolina + água <=> 2-acil glicero- fosfocolina + um ânion de ácido graxo Comentário: tem uma especificidade muito mais ampla do que a EC 3.1.1.4.
[0044] Fosfolipase A2 é definida de acordo com a classificação europeia (EC) de enzima padrão como EC 3.1.1.4 Nome Oficial: Fosfolipase A2. Nomes Alternativos: fosfatidilcolina 2-acil hidrolase, leciti- nase a, fosfatidase ou fosfatidolipase. Reação catalisada: fosfatidilcolina + água <=> i-acil glicero- fosfocolina + um ânion de ácido graxo Comentário: também age na fosfatidiletanolamina, colina plasmalogen e fosfatídeos, removendo o ácido graxo ligado à posição
2.
[0045] A fosfolipase pode ser de qualquer origem, por exemplo, de origem animal (tal como, por exemplo, mamífero), por exemplo, do pâncreas (por exemplo, bovino ou suíno), ou veneno de cobra ou ve- neno de abelha. Alternativamente, a fosfolipase pode ser de origem microbiana, por exemplo, de fungos filamentosos, leveduras ou bacté- rias, tal como o gênero ou espécie Aspergillus, por exemplo, A. niger; Dictyostelium, por exemplo, D. discoideum; Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Rhizomucor, por exemplo, R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, por exemplo, S. li- bertiana; Trichophyton, por exemplo, T. rubrum; Whetzelinia, por exemplo, W. sclerotiorum; Bacillus, por exemplo, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, por exemplo, C. freundii; Enterobacter, por exem- plo, E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por exemplo, E. herbicola; Escherichia, por exemplo, E. coli; Klebsiella, por exemplo, K. pneumoniae; Proteus, por exemplo, P. vulgaris; Providen- cia, por exemplo, P. stuartii; Salmonella, por exemplo, S. typhimurium; Serratia, por exemplo, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por exemplo, S. flexneri; Streptomyces, por exemplo, S. violeceoruber; Yersinia, por exemplo, Y. enterocolitica. A fosfolipase pode ser um fungo, por exemplo, da classe Pyrenomycetes, tal como o gênero Fu- sarium, tal como uma cepa de F. culmorum, F. heterosporum, F. sola- ni, F. venenatum, ou uma cepa de F. oxysporum. A fosfolipase pode também ser de uma cepa de fungo filamentoso com o gênero Asper- gillus, tal como uma cepa de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Uma fosfolipase preferida é derivada de uma cepa de Fusarium, particular- mente de F. venenatum ou F. oxysporum, por exemplo, da cepa DSM
2672 como descrito m WO 98/26057, especialmente descrito na rei- vindicação 36 de WO 98/26057. Em outra configurações, a fosfolipase é uma fosfolipase como divulgada em in WO 00/32758 (Novozymes A/S, Dinamarca). Outra fosfolipase A preferida é a fosfolipase A2 de Streptomyces, tal como por exemplo, PLA2 de S. violaceoruber.
[0046] Fosfolipases estão disponíveis comercialmente. Fosfolipase A1 de Thermomyces lanuginosus/Fusarium oxysporum expressada em Aspergillus oryzae está disponível sob a marca Lecitase®Ultra (No- vozymes A/S, Dinamarca). Outra fosfolipase A1 preferida está disponí- vel sob a marca YieldMAX® ou YieldMAX®PL (Chr. Hansen A/S, Dina- marca), que é produzida a partir da fermentação submergida de uma cepa de Aspergillus oryzae.
[0047] Uma fosfolipase particularmente preferida é fosfolipase A1 de Fusarium spp.
[0048] Fosfolipase A2 pode ser encontrada sob diferentes marcas comerciais. Por exemplo. fosfolipase A2 de origem animal (pâncreas suíno), desenvolvido para a degomagem de óleos vegetais, está dis- ponível sob Lecitase ®10L (Novozymes A/S, Dinamarca). Maxapal® A2 (DSM Food Specialties, Países Baixos) é produzida pela fermentação microbiana de uma cepa selecionada de Aspergillus niger, desenvolvi- da para melhorar as propriedades emulsificantes de ovo e gema de ovo. CakeZyme® e BakeZyme® também são fosfolipase A2 microbia- na, comercializadas pela DSM Food Specialties (Países Baixos). Ou- tros exemplos incluem fosfolipase A2 microbiana Rohalase®MPL (AB Enzymes, Alemanha) e LysoMax® (Genencor, EUA).
[0049] Em uma modalidade preferida, a fosfolipase é YieldMAX® ou YieldMAX®PL (Chr. Hansen A/S, Dinamarca). Outras fosfolipases de grau alimentício são bem conhecidas das pessoas versadas na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, Casado, Víctor, et al. "Phospholipases in food industry: a review." Lipases and Phospholipa-
ses: Methods and Protocols (2012): 495-523.
[0050] Em algumas configurações, a fosfolipase(s) usada no pro- cesso da invenção é derivada ou obtida de qualquer uma das fontes aqui mencionadas. O termo "derivada" significa, neste contexto, que a fosfolipase pode ter sido isolada de um organismo onde está presente nativamente, ou seja, a identidade da sequência de aminoácidos da enzima é idêntica a uma enzima nativa. O termo "derivada" também significa que as enzimas podem ter sido produzidas recombinantemen- te em um organismo hospedeiro, a enzima recombinante produzida, tendo ou uma identidade idêntica a uma enzima nativa ou tendo uma sequência de aminoácidos modificada, por exemplo, tendo um ou mais aminoácidos que são excluídos, inseridos e/ou substituídos, ou seja, uma enzima recombinante produzida que é um mutante e/ou um frag- mento de uma sequência de aminoácidos nativos. Dentro do significa- do de uma enzima nativa estão incluídas variantes naturais. Além dis- so, o termo "derivada" inclui enzimas produzidas sinteticamente, por exemplo, pela síntese de peptídeos. O termo "derivada" também abrange enzimas que foram modificadas, por exemplo, por glicosila- ção, fosforilação etc., seja in vivo ou in vitro. O termo "obtenível" neste contexto significa que a enzima tem uma sequência de aminoácidos idêntica a uma enzima nativa. O termo abrange uma enzima que foi isolada de um organismo onde está presente nativamente, ou uma em que foi expressada recombinantemente no mesmo tipo de organismo ou outro, ou enzimas produzidas sinteticamente, por exemplo, pela síntese de peptídeos. Com relação à enzima produzida recombinan- temente, os termos "obtenível" e "derivada" referem-se à identidade da enzima e não à identidade do organismo hospedeiro em que é produ- zida recombinantemente.
[0051] Em conformidade, a fosfolipase pode ser obtida a partir de um microrganismo por meio de qualquer técnica adequada. Por exem-
plo, uma preparação de enzima fosfolipase pode ser obtida por fer- mentação de um microrganismo adequado e posterior isolamento de uma fosfolipase do caldo fermentado resultante ou microrganismo, por métodos conhecidos na técnica. A fosfolipase também pode ser obtida por meio de técnicas de DNA recombinante. Tal método normalmente compreende o cultivo de uma célula hospedeira, transformada com um vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA codificando a fosfolipase em questão, e a sequência de DNA sendo operacionalmente ligada a um sinal de expressão apropriado, de tal forma que é capaz de expressar a fosfolipase em um meio de cultura em condições que permitem a expressão da enzima e recuperam a enzima da cultura. A sequência de DNA também pode ser incorporada ao genoma da célula hospedeira. A sequência de DNA pode ser de origem genômica, cDNA ou sintética ou quaisquer combinações des- tas, podendo ser isolada ou sintetizada de acordo com métodos co- nhecidos na técnica. Tal fosfolipase pode ser purificada. O termo "puri- ficada" como aqui usado, abrange enzima fosfolipase livre de compo- nentes do organismo do qual é derivada. O termo "purificada" também abrange enzima fosfolipase livre de componentes do organismo nativo do qual é obtida; também é denominada fosfolipase "essencialmente pura" e pode ser particularmente relevante para fosfolipases que ocor- rem naturalmente e que não foram modificadas geneticamente, tal como por exclusão, substituição ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos. A purificação pode ser feita por filtração, precipitação ou cromatografia, por exemplo.
[0052] As fosfolipases utilizadas no presente pedido podem estar em qualquer forma adequada, tal como na forma de um pó seco ou granulado, um granulado sem poeira, um líquido, um líquido estabili- zado ou uma enzima protegida. Granulados podem ser produzidos, por exemplo, conforme divulgado nas patentes norte-americanas Nº.
4.106.991 e Nº. 4.661.452, podendo opcionalmente ser revestidos por métodos conhecidos na técnica. As preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas adicionando estabilizadores, tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol, ácido de ácido lático ou outro ácido orgânico, de acordo com métodos estabele- cidos. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método divulgado na patente europeia Nº. 238.216.
[0053] A atividade de uma fosfolipase pode ser determinada como a taxa de consumo de hidróxido de sódio durante a neutralização do ácido graxo. Tal atividade pode ser expressa em unidades de Lecitase (LEU) em relação a um padrão de Lecitase (fosfolipase). Os procedi- mentos são conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade de fosfo- lipase A1 pode ser medida em relação a um padrão fosfolipase, usan- do lecitina como um substrato. Fosfolipase A1 catalisa a hidrólise da lecitina à liso-lecitina e a um ácido graxo livre. O ácido graxo liberado é titulado com hidróxido de sódio 0,1 N, sob condições padrão (pH=8,0; 40° ±0,5). 1 LEU é definida como a quantidade de enzima que, em condições padrão (pH=8,0; 40° ±0,5), resulta na mesma taxa de con- sumo de hidróxido de sódio (em microeq/min) como o padrão Lecitase diluído a uma atividade nominal de 1 LEU/g. O método pode ser reali- zado utilizando tanto um sistema automatizado, como equipamento de laboratório padrão para a realização de experimentos de titulação. Adição de fosfolipase
[0054] A fosfolipase pode ser adicionada à base de leite antes, no início ou durante a fermentação. A expressão "no início da fermenta- ção" significa logo antes, ao mesmo tempo que, ou logo após a adição da cultura iniciadora à base de leite. Aqui, o termo "logo" significa me- nos de 30 minutos. A expressão "durante a fermentação" significa a qualquer momento durante a fermentação, após o início e antes do fim da fermentação.
[0055] Em uma modalidade da presente invenção, a fosfolipase é adicionada à base de leite antes da etapa de fermentação. Em outra modalidade da presente invenção, a fosfolipase é adicionada à base de leite no início da etapa de fermentação. Em outra modalidade da presente invenção, a fosfolipase é adicionada ao leite fermentado du- rante a fermentação. A etapa de fermentação pode ser terminada por tratamento de resfriamento.
[0056] A quantidade de fosfolipase a ser adicionada à base de lei- te depende de uma série de parâmetros, incluindo a atividade de fosfo- lipase e a composição da base de leite, tal como o teor de gordura etc. Tal quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina.
[0057] Condições adequadas para a realização do tratamento da fosfolipase podem ser determinadas por uma pessoa qualificada, usando métodos conhecidos na técnica para otimizar reações enzimá- ticas. A pessoa qualificada saberá como ajustar parâmetros como pH, temperatura e quantidade de fosfolipase, para alcançar os resultados desejados, levando em consideração as propriedades desejadas no produto leite fermentado. A quantidade de fosfolipase a ser utilizada no método da invenção pode depender da atividade da fosfolipase espe- cífica nos fosfolipídios presentes nas condições específicas de trata- mento. Por exemplo, quando uma fosfolipase A é usada como mostra- do no exemplo, a quantidade de fosfolipase adicionada pode ser entre 0,1 e 50 LEU por grama de gordura, tal como entre 0,5 e 25, ou entre 1 e 10 LEU por grama de gordura. Produtos de leite fermentado
[0058] O termo "produto leite fermentado" é um termo geralmente definido de acordo com as regulamentações oficiais relevantes e os padrões são bem conhecidos no campo. A expressão "produto de leite fermentado" significa um produto alimentar ou de ração em que a pre- paração produto alimentar ou ração envolve a fermentação de uma base de leite com uma bactéria de ácido lático "Produto de leite fer- mentado", como aqui usado inclui, mas não se limita a produtos, tais como produtos de leite fermentado termofílico (por exemplo, iogurte) e produtos de leite fermentado mesofílico (por exemplo, creme de leite e leite de manteiga, bem como soro fermentado, quark e queijo fresco). Em contraste com os produtos de queijo, os produtos de leite fermen- tado geralmente têm menor pH alvo no final da fermentação.
[0059] Mais particularmente, o processo aqui divulgado pode ser aplicado para obter produtos de leite fermentado termofílico, como io- gurte e particularmente iogurte cremoso e leite fermentado mesofílico, tal como quark.
[0060] Em uma modalidade da invenção, o produto de leite fer- mentado é um produto de iogurte. O termo "iogurte" tem seu significa- do habitual e é geralmente definido de acordo com regulamentos e padrões oficiais relevantes são bem conhecidos no campo. Um produ- to de iogurte pode ser selecionado no grupo composto por "produto tipo batido", "produto tipo cremoso" ou "produto de beber".
[0061] "Produto tipo batido" é um produto de leite fermentado que sustenta um tratamento mecânico após a fermentação. O tratamento mecânico é tipicamente, mas não obtido exclusivamente, por agitar ou bater, bombear, filtrar ou homogeneizar o gel, ou por misturar com ou- tros ingredientes. "Produto tipo cremoso" é um produto à base de leite que foi inoculado com uma cultura iniciadora, por exemplo, uma cultu- ra iniciadora, e embalado e fermentado na embalagem. O termo "pro- duto de beber" inclui bebidas, tais como "iogurte de beber", "iogurte de beber diluído" ou similares, que podem ser um produto de leite produ- zido por fermentação pela combinação de espécies Lactobacillus e Streptococcus thermophilus.
[0062] Em uma modalidade preferida, o produto de leite fermenta- do é selecionado do grupo composto por quark, cream cheese, queijo fresco, iogurte grego, iogurte de soja, skyr, labneh, leite de manteiga, creme de leite azedo, leite coalhado, leite cultivado, kefir, lassi, ayran, twarog, doogh, smetana, yakult e dahi. Mais preferivelmente, o produto de leite fermentado é leite coalhado, leite cultivado, kefir, lassi, ayran, doogh, yakult ou dahi. Teor de proteína
[0063] Os produtos de leite fermentado, produzidos pelo processo conforme aqui divulgado, podem conter proteína em um teor entre 0,5% em peso a 10% em peso. O produto de leite fermentado também pode ser um produto de baixa proteína, com um teor de proteína entre 1% em peso e 4,0% em peso. Alternativamente, o produto de leite fermentado pode ser um produto de alta proteína com um teor de pro- teína acima de 3,5% em peso.
[0064] Em uma modalidade particular da invenção, a base de leite é caracterizada por um teor de proteína (peso/peso) menor que 0,5%, menor que 0,7%, menor que 0,9%, menor que 1,0%, menor que 1,3%, menor que 1,5%, menor que 2,0%, menor que 2,0%, menor que 2,0%, menor que 2,0%, menor que 2,0%, menor que 1,0%, menor que 2,0%, menor que 2,5%, menor que 3,0%, menor que 3,5%, menor que 4,0%, menor que 4,5%, menor que 5,0%, menor que 5,5%, menor que 6,0%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5%, menor que 6,5 7,0%, menor que 7,5%, menor que 8,0%, menor que 8,5%, menor que 9,0%, menor que 9,5%, menor que 10,0%, menor que 10,5%, menor que 11,0%, menos mais de 11,5%, menor que 12,0%, menor que 12,5%, menor que 13,0%, menor que 13,5%, menor que 14,0%, menor que 14,5%, ou menor que 15,0%.
Teor de gordura
[0065] Os inventores do presente pedido descobriram os impactos positivos das fosfolipases na textura dos produtos de leite fermentado. Observou-se que o impacto é maior quando o nível de gordura da ba- se de leite é maior, tornando-o especialmente adequado para uso em produtos fermentantes contendo maior teor de gordura.
[0066] Em configurações especiais da invenção, a base de leite é caracterizada por um teor de gordura (peso/peso) de pelo menos 0,5%, tal como pelo menos 0,6%, pelo menos 0,7%, pelo menos 0,8%, pelo menos 0,9%, pelo menos 1,0%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,3%, pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 3,5%, pelo menos 4,0%, pelo menos 4,5%, pelo menos 5,0%, pelo menos 5,5%, pelo menos 6,0%, pelo menos 6,5%, pelo menos 7,0%, pelo menos 7,5%, pelo menos 8,0%, pelo menos 8,5%, pelo menos 9,0%, pelo menos 9,5%, pelo menos 10,5%. 0%, pelo menos 10,5%, pelo menos 11,0%, pelo menos 11,5%, pelo me- nos 12,0%, pelo menos 12,5%, pelo menos 13,0%, pelo menos 13,5%, pelo menos 14,0% , pelo menos 14,5% ou pelo menos 15,0%. Em al- gumas configurações o teor de gordura é de pelo menos 16,0%, pelo menos 17,0%, pelo menos 18,0%, pelo menos 19,0%, pelo menos 20,0%, pelo menos 21,0%, pelo menos 22,0%, pelo menos 23,0%, pe- lo menos 24,0%, em pelo menos 25,0%, pelo menos 26,0%, pelo me- nos 27,0%, pelo menos 28,0%, pelo menos 29,0%, pelo menos 30,0%, pelo menos 35,0%, pelo menos 40,0%, pelo menos 45,0%, pelo me- nos 50,0% ou mais. O ajuste do teor de gordura em uma base de leite é conhecido por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, adicio- nando nata à base de leite.
[0067] Em configurações preferidas, a base de leite é caracteriza-
da por um teor de gordura de 0,5% a 10,0% (peso/peso), preferivel- mente de 1,0% a 9,0%, preferivelmente de 3,0% a 7,0%, preferivel- mente de 4,0% a 6,0%, e mais preferivelmente de 4,5% a 5,5%. Des- cobriu-se que o efeito de fosfolipase(s) na textura é maior que o teor de gordura é mais alto. Homogeneização
[0068] Seguindo o ensinamento da presente invenção, é possível prover produtos de leite fermentado onde o nível de homogeneização normalmente exigido para tais produtos, é reduzido ou mesmo elimi- nado, com isso reduzindo os custos operacionais para o fabricante. Assim, em uma modalidade, a base de leite utilizada para o preparo de tal produto, não é homogeneizada. No entanto, em alguma modalidade preferida, dependendo dos tipos de leite fermentado, a base de leite pode ainda ser homogeneizada. O nível de homogeneização é prefe- rencialmente inferior a 250 bar, incluindo menos de 240 bar, menos de 220 bar, menos de 200 bar, menos de 190 bar, Menos de 180 bares, menos de 170 bares, menos de 160 bar, menos de 150 bar, menos de 140 bar, menos de 130 bar, menos de 120 bar, menos de 110 bar, menos de 100 bar, menos de 90 bar, menos de 80 bar, menos de 70 bar, menos de 60 bar, menos de 50 bar. No contexto do presente pe- dido, se a homogeneização for realizada em múltiplas etapas, o nível de homogeneização refere-se à pressão total aplicada em todas as etapas. Por exemplo, se a homogeneização for realizada em duas etapas, numa primeira a 120 bar e numa segunda a 60 bar, o nível de homogeneização da base de leite é de 180 bar. Quimosina
[0069] Os inventores do presente pedido de patete também des- cobriram que a adição ulterior de quimosina (EC 3.4.23.4) pode melho- rar vantajosamente a textura do produto de leite fermentado. A quimo- sina é uma protease aspártica pertencente a uma ampla classe de peptidases e é comumente usada na fabricação de queijo como uma enzima de coagulação de leite.
[0070] A quimosina bovina, em particular a quimosina de vitelo, é comercialmente disponível tanto como extratos de enzimas estoma- cais (coalhos; compreendendo a quimosina produzida nativamente), quanto como quimosina produzida recombinantemente (que é tipica- mente expressa em células hospedeiras bacterianas, de leveduras ou fúngicas) (veja, por exemplo, WO 95/29999). Outras quimosinas não bovinas, tal como quimosina de Camelus dromedarius ou variantes delas, foram descritas em WO2002036752, WO2013174840 e WO2015/128417. As quimosinas preferidas incluem as quimosinas disponíveis comercialmente, tal como CHY-MAX® , CHY-MAX® M e CHY-MAX® Plus (Chr. Hansen A/S Dinamarca).
[0071] Em uma modalidade preferida, o processo compreende adicionalmente a etapa de adicionar uma quimosina à base de leite antes, no início ou durante o período de fermentação. A quantidade de quimosina a ser adicionada à base de leite depende de uma série de parâmetros, incluindo a atividade da quimosina, a composição da base de leite, tal como o teor de proteínas como teor de caseína, etc. Con- dições adequadas podem ser selecionadas pela pessoa versada na técnica e de acordo com métodos conhecidos na técnica para otimizar reações enzimáticas. Ensaios para determinar a atividade da quimosi- na são conhecidos na técnica. Pode ser medida de acordo com um método padronizado e expresso em Unidades Internacionais de Coa- gulação de Leite por grama (IMCU/g).
[0072] Em uma modalidade preferida, o processo compreende adicionalmente a etapa de adicionar uma quimosina à base de leite antes, no início ou durante o período de fermentação. A quantidade de quimosina a ser adicionada à base de leite depende de uma série de parâmetros, incluindo a atividade da quimosina, a composição da base de leite, tal como o teor de proteínas como teor de caseína, etc. Con- dições adequadas podem ser selecionadas pela pessoa versada na técnica e de acordo com métodos conhecidos na técnica para otimizar reações enzimáticas. Ensaios para determinar a atividade da quimosi- na são conhecidos na técnica. Pode ser medida de acordo com um método padronizado e expresso em Unidades Internacionais de Coa- gulação de Leite por grama (IMCU/g).
[0073] Em uma modalidade, o processo para produzir um produto de leite fermentado compreende a adição de uma cultura iniciadora com pelo menos uma cepa de bactérias de ácido lático a uma base de leite, fermentando a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado, em que fosfolipase e quimosina são adiciona- das ao mesmo tempo ou uma após a outra à base de leite, no início do período de fermentação.
[0074] Em uma modalidade preferida, o processo para produzir um produto de leite fermentado termofílico compreende a adição de uma cultura iniciadora com pelo menos uma cepa de bactérias de ácido lá- tico a uma base de leite, fermentando a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado, em que fosfolipase e quimosina são adicionadas separadamente à base de leite, antes do período de fermentação.
[0075] Em ainda outra modalidade preferida, o processo para pro- duzir um iogurte compreende a adição de uma cultura iniciadora com pelo menos uma cepa de bactérias de ácido lático a uma base de leite, fermentando a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado, em que fosfolipase e quimosina são adicionadas ao mesmo tempo à base de leite, durante o período de fermentação. Armazenamento
[0076] O produto de leite fermentado é preferivelmente armazena- do por pelo menos dois dias, por exemplo, por pelo menos 3 dias, por pelo menos 4 dias, mais preferivelmente por pelo menos 5 dias, por pelo menos 6 dias, por pelo menos 7 dias, por pelo menos 8 dias, por pelo menos 9 dias, por pelo menos 10 dias, por pelo menos 11 dias, por pelo menos 12 dias, por pelo menos 13 dias e por pelo menos 14 dias. No negócio de laticínios frescos, os produtos normalmente che- gam ao consumidor em torno de 3 a 5 dias e geralmente não mais tar- de do que 7 dias após a produção.
[0077] Como usado aqui, os termos “armazenagem” ou “armaze- nado” referem-se à detenção de produtos sob condições adequadas até que eles sejam enviados aos consumidores para consumo. Tais condições são conhecidas na indústria e podem ser determinadas pe- los praticantes versados. Kit
[0078] Em outro aspecto, a presente invenção provê um kit com- preendendo uma cultura iniciadora e um ou mais fosfolipase(s). A cul- tura iniciadora compreende uma ou mais bactérias de ácido lático úteis para produzir produtos de leite fermentado, como mencionado no pre- sente pedido de patente. As bactérias de ácido lático contidas no kit podem, por exemplo, incluir as bactérias Lactobacillus spp. e Lacto- coccus spp. Eles podem ser na forma de culturas congeladas ou secas congeladas para propagação iniciadora a granel ou como as chama- das culturas "Direct Vat Set" (DVS) destinadas à inoculação direta em um vaso de fermentação ou um tanque para a produção de um produ- to de leite fermentado. A fosfolipase incluída no kit pode ser fosfolipase A, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase B ou fosfolipase C ou uma combinação destas. O kit pode ainda incluir uma ou mais quimo- sinas. Textura de produtos de leite fermentado
[0079] A presente invenção também provê um novo uso de fosfoli- pase para melhorar a textura de produtos de leite fermentado. A textu-
ra pode ser caracterizada, com respeito às propriedades reológicas, usando métodos que são bem conhecidos na técnica, incluindo medir a "tensão de cisalhamento (viscosidade)" ou "firmeza de gel" do produ- to. A unidade do SI para tensão de cisalhamento estresse e firmeza de gel é o pascal (Pa). Foi observado pelos inventores que tanto a firme- za do gel quanto a viscosidade podem ser melhoradas.
[0080] Em configurações particulares, o uso permite um aumento da viscosidade do produto de leite fermentado, tal como o iogurte me- dido a 13ºC, a uma taxa de cisalhamento de 60 1/s, após 7 dias de armazenamento.
[0081] O termo "tensão de cisalhamento" determina viscosidade. A viscosidade (a unidade é Pas) é definida como "tensão de cisalhamen- to" (Pa)/Taxa de cisalhamento (1/s). O valor da tensão de cisalhamen- to pode ser registrado em diferentes pontos. Experimentos sensoriais têm mostrado que as melhores correlações entre medições reológicas e sensoriais são encontradas quando a viscosidade é medida a uma taxa de cisalhamento de 60 1/s (correlacionando bem com a primeira impressão na boca) e a uma taxa de cisalhamento de 300 1/s (coesão correlacionando com dificuldade de engolir).
[0082] A "firmeza de gel" dos produtos de leite fermentado pode ser medida por uma assim chamada varredura de frequência, medindo o módulo complexo (G*) do gel em função da frequência de oscilação. O valor de G* a 1,52 Hz pode ser usado como a "firmeza de gel" do produto. A viscosidade do produto pode ser medida pela assim cha- mada medida da taxa constante, medindo a tensão de cisalhamento do produto como função da taxa de cisalhamento.
[0083] O produto de leite fermentado produzido de acordo com o ensino da presente invenção pode alcançar um aumento na viscosida- de ou firmeza de gel em comparação com um produto de controle, que é um produto de leite fermentado produzido da mesma forma, porém sem usar fosfolipase, medido a uma taxa de cisalhamento de 60 1/s ou 300 1/s.
[0084] Em uma modalidade, quando medida como tensão de cisa- lhamento a 60 1/s (Pa), o uso de fosfolipase gera uma viscosidade em um produto de leite fermentado que é pelo menos cerca de 5% mais alta, pelo menos cerca de 10% mais alta, pelo menos cerca de 15% mais alta, pelo menos cerca de 20% mais alta, pelo menos cerca de 25% mais alta, pelo menos cerca de 30% mais alta, pelo menos cerca de 35% mais alta, pelo menos cerca de 40% mais alta, pelo menos cerca de 50% mais alta, do que a viscosidade gerada por um produto onde a fosfolipase não é utilizada.
[0085] Em outra modalidade, quando medida como tensão de ci- salhamento a300 1/s (Pa), o uso de fosfolipase gera uma viscosidade em um produto de leite fermentado que é pelo menos cerca de 5% maior, pelo menos cerca de 10% maior, pelo menos cerca de 15% maior, pelo menos cerca de 20% maior, pelo menos cerca de 25% maior, pelo menos cerca de 30% maior, pelo menos cerca de 35% maior, pelo menos cerca de 40% maior do que a viscosidade gerada por um produto onde a fosfolipase não é utilizada.
[0086] Em outra modalidade , o uso de fosfolipase gera uma fir- meza de gel (G* a 1,52 Hz) em um produto de leite fermentado que é pelo menos cerca de 5% maior, pelo menos cerca de 10% maior, pelo menos cerca de 15% maior, pelo menos cerca de 20% maior, pelo menos cerca de 25% maior, pelo menos cerca de 30% maior do que a firmeza de gel gerada por um produto onde a fosfolipase não é usada.
[0087] O uso dos termos "um" e "uma" e "o" ou “os” e referências similares no contexto da descrição desta invenção (especialmente no contexto das seguintes alegações), devem ser interpretados para co- brir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contrariado pelo contexto. Os termos "com-
preendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser interpreta- dos como termos abertos (ou seja, que significam "incluindo, mas não se limitando a") a menos que seja observado de outra forma. As indi- cações de faixas de valores aqui são meramente destinadas a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que se enquadra na faixa, a menos que indicado de outra forma aqui, e cada valor separado é incorporado na especificação co- mo se fosse indicado individualmente aqui. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a me- nos que indicado aqui ou de outra forma claramente contrariado pelo contexto. Salvo afirmado de outra forma, todos os valores exatos aqui fornecidos são representativos de valores aproximados corresponden- tes (por exemplo, todos os valores exemplares exatos fornecidos em relação a um determinado fator ou medida podem ser considerados para fornecer também uma medida aproximada correspondente, modi- ficada por "sobre", quando apropriado). O uso de qualquer um e todos dos exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, " tal como") aqui provida, destina-se apenas a ilustrar melhor a invenção e não repre- senta uma limitação no escopo da invenção, a menos que seja reivin- dicado de outra forma. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção.
[0088] A invenção aqui descrita e reivindicada, não deve ser limi- tada em escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que esses aspectos são destinados a ilustrar vários aspectos da in- venção. Quaisquer aspectos equivalentes são destinados a estar den- tro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da inven- ção, adicionalmente às mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão apa- rentes para aqueles versados na técnica, a partir da descrição anterior e dos seguintes exemplos. Tais modificações também se destinam a se enquadrar no escopo das reivindicações anexadas. Em caso de conflito, prevalecerá a presente divulgação, incluindo definições. Exemplo 1
[0089] Foram preparados produtos de iogurte contendo 1,5% ou 5,0% de gordura. Foram avaliados os efeitos da fosfolipase nas pro- priedades reológicas no dia 7 e dia 30. Preparação da base de leite:
[0090] Leite em pó desnatado e o leite em pó integral (Fonterra Cooperative Group Limited, Nova Zelândia) foram usados para prepa- rar a base de leite para os seguintes exemplos. Tabela 1: Composição da base de ( % em peso) Amostra Leite em pó des- Leite em pó inte- Água natado gral 1 8,60% 5,30% 86,10% 2 8,60% 5,30% 86,10% 3 8,10% 9,00% 82,90% 4 8,10% 9,00% 82,90%
[0091] Os ingredientes foram misturados com água com um mistu- rador Silverson, a 45°C – 50°C. O tempo de hidratação foi de 20 minu- tos. A base de leite foi homogeneizada com homogeneizador GEA Lab em duas etapas (primeira etapa a 150 bar e segunda etapa a 50bar; no total: 200 bar) e pasteurizada a 85°C por 30 min e esfriada. Cultura iniciadora:
[0092] A cultura iniciadora foi composta por Streptococcus ther- mophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus. Fosfolipase:
[0093] Fosfolipase A1 (YieldMAX®PL de Chr. Hansen A/S, Dina- marca; atividade média 2600 LEU/ml, dosagem 0,021650% para 5% de gordura) foi adicionada no início da fermentação. O teor de gordura e proteína foi determinado por meio da análise MilkoScan.
Fermentação:
[0094] A fermentação foi realizada a 43°C , por quatro horas e 50 minutos e um pH final de 4,55 ± 0,05 foi alcançado. O produto fermen- tado foi resfriado através de um trocador de calor de placa, pós-tratado a 23°C –25°C e suavizado, com uma válvula de contra pressão, a uma pressão de 1 bar na saída do refrigerador.
[0095] As amostras foram armazenadas à temperatura de ambien- te frio (5 °C – 7°C). Tabela 2: Detalhes de composição e fermentação. Amostra Teor de Teor de Fosfolipase pH fi- Tempo de fermen- proteína gordura nal tação 1 4,00% 1,50% -- 4,51 4 horas 50 min. 2 4,00% 1,50% 0,00345% 4,49 4 horas 50 min. 3 4,00% 5,00% -- 4,51 4 horas 50 min. 4 4,00% 5,00% 0,01265% 4,49 4 horas 50 min.
[0096] As amostras armazenadas no dia 7 e dia 30 foram testadas quanto a viscosidade e firmeza do gel. Medida da firmeza de gel e tensão de cisalhamento:
[0097] As propriedades reológicas da amostra foram avaliadas em um reômetro (Anton Paar Modular Compact Rheometer MCR 302, An- ton Paar® GmbH, Áustria). O reômetro foi ajustado para uma tempera- tura constante de 13°C durante o tempo de medida. O programa Stir- red_oscillation+Up_DownFlow foi utilizado.
[0098] A tensão de cisalhamento em 60 1/s e em 300 1/s foi esco- lhida para análise, pois isso se correlaciona com a textura na boca (pa- ladar, primeira impressão) e coesão (ao engolir um produto de leite fermentado).
[0099] A firmeza de gel (Módulo Complexo G* em 1,52) foi avalia- da em um reômetro (Anton Paar Modular Compact Rheometer MCR 302, Anton Paar® GmbH, Áustria).
[00100] Os resultados são dados abaixo e a curva de histerese é mostrada na Figura 1. Tabela 3: Avaliação reológica das amostras no dia 7 Amostra Paladar, primeira impressão Coesão, dificuldade de engo- (viscosidade a 60 1/s) lir (viscosidade a 300 1/s) 1 422,71 119,44 2 475,66 128,50 3 907,30 196,31 4 1092,9 212,45 Tabela 4: Avaliação reológica das amostras no dia 30 Amostra Paladar, primeira impressão Coesão, dificuldade de engo- (viscosidade a 60 1/s) lir (viscosidade a 300 1/s) 1 412,25 110,38 2 495,85 128,72 3 966,16 202,41 4 1078,80 207,96
[00101] Como mostrado nas Tabelas 3 e 4, as amostras tratadas com fosfolipase (amostra 2 e 4) mostraram ter melhorado a viscosida- de em 60 1/s (paladar, primeira impressão) e em 300 1/s (coesão), em comparação com as amostras de controle (amostra 1 e 3). Os efeitos foram mais fortes na amostra com maior teor de gordura (amostra 4). Exemplo 2
1. Ajuste experimental
[00102] Um projeto fatorial-fracionado foi escolhido para verificar os seguintes 5 fatores em 16 ensaios. O objetivo é confirmar o efeito das fosfolipases na textura em um projeto maior e verificar a significância, interação com nível de pressão de homogeneização e interação com uma enzima de quimosina, bem como interação com culturas iniciado- ras. Tabela 5: Ajuste experimental dos fatores
[00103] Os fatores foram codificados ortogonalmente:
Fatores -1 +1 1- pressão de homogeneização 150 bar 300 bar 2- Cultura iniciadora 1 2 3- Teor de proteína 2,50% 4,50% 4- Quimosina não sim 5- Fosfolipase não sim Tabela 6: Ajuste experimental: projeto Número Fator 1 Fator 2 Fator 3 Fator 4 Fator 5 do teste Pressão de Ho- Cultura Teor de Quimosi- Fosfoli- mogeneização iniciadora proteína na pase 1 - - - - + 4 + + - - + 6 + - + - + 7 - + + - + 2 + - - + + 3 - + - + + 5 - - + + + 8 + + + + + 9 - - - + - 10 + - - - - 11 - + - - - 12 + + - + - 13 - - + - - 14 + - + + - 15 - + + + - 16 + + + - -
Tabela 7: Estrutura aliasing 1 2345 2 1345 3 1245 4 1235
[00104] O quinto fator é estudado na interação da terceira ordem (5=1234). Portanto, todas as interações de primeira ordem podem ser estimadas com boa precisão, considerando que a interação de segun- da ordem tem uma alta probabilidade de ser muito pequena ou nula.
2. Procedimento
[00105] Foram preparados produtos de iogurte contendo 5,0% de gordura com parâmetros variados. Preparação da base de leite:
[00106] Leite em pó desnatado e creme de leite em pó (Fonterra Cooperative Group Limited, Nova Zelândia) foram usados para prepa- rar a seguinte base de leite. Tabela 8: Composição da base de leite 1 (Proteína = 2,50%, Gordura = 5,00%) Ingrediente Dosagem (%) Leite em pó desnatado 3,39 Creme de leite em pó 9,07 Água 87,54
Tabela 9: Composição da base de leite 2 (Proteína = 4,50%, Gordura = 5,00%) Ingrediente Dosagem (%) Leite em pó desnatado 9,68 Creme de leite em pó 8,98 Água 81,34
[00107] Leite em pó, creme de leite em pó e água foram misturados com um misturador Silverson a 8°C -10°C , por pelo menos 2 horas. A base de leite foi homogeneizada com o homogeneizador Gea Lab. Dependendo do ajuste, a homogeneização foi realizada em 150 bar (primeira etapa 120 bar e segunda etapa 30 bar) ou em 300 bar (pri- meira etapa 240 bar e segunda etapa 60 bar). A base de leite homo- geneizada foi então pasteurizada a 85°C, por 30 min e resfriada. Preparação e Fermentação:
[00108] Dependendo do ajuste, fosfolipase e/ou quimosina foram adicionadas no início da fermentação, juntamente com a cultura inicia- dora. Cultura iniciadora:
[00109] A cultura iniciadora do Exemplo 1 foi utilizada (cultura inici- adora 1, nível 1). Uma segunda cultura iniciadora (cultura iniciadora 2, nível+1) com cinética de fermentação diferente, foi incluída para com- paração. Ambas as culturas iniciais eram compostas por Streptococ- cus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Fosfolipase e quimosina:
[00110] Fosfolipase A1 (YieldMAX®PL de Chr. Hansen A/S, Dina- marca; atividade média 2600 LEU/ml, dosagem 0,021650% para 5% de gordura)
[00111] Quimosina bovina (CHY-MAX®Plus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca; atividade média 200 IMCU/ml, dosagem de 0,00026% pa- ra 2% de caseína). O teor de gordura e proteína foi determinado utili- zando análise MilkoScan.
Tabela 10: Detalhes de composição e fermentação das amostras 1-16 Amostra Homo. Cultura Proteína Quimo- Fosfoli- Tempo pH final (bar) iniciado- sina (%) pase ferment. ra (%) 1 150 1 2,50% 0 0,01265 3 h 55 m 4,47 2 300 1 2,50% 0,00026 0,01265 3 h 55 m 4,47 3 150 2 2,50% 0,00026 0,01265 4 h 35 m 4,52 4 300 2 2,50% 0 0,01265 4 h 35 m 4,54 5 150 1 4,50% 0,00046 0,01265 5 h 30 m 4,52 6 300 1 4,50% 0 0,01265 5 h 00 m 4,51 7 150 2 4,50% 0 0,01265 6 h 25 m 4,56 8 300 2 4,50% 0,00046 0,01265 6 h 25 m 4,52 9 150 1 2,50% 0,00026 0 4 h 10 m 4,52 10 300 1 2,50% 0 0 4 h 10 m 4,52 11 150 2 2,50% 0 0 4 h 20 m 4,54 12 300 2 2,50% 0,00026 0 4 h 20 m 4,55 13 150 1 4,50% 0 0 5 h 00 m 4,54 14 300 1 4,50% 0,00046 0 5 h 00 m 4,53 15 150 2 4,50% 0,00046 0 6 h 35 m 4,54 16 300 2 4,50% 0 0 6 h 35 m 4,53
[00112] A fermentação foi realizada a 43°C, até que um pH de 4,55 ± 0,05 foi alcançado. O tempo de fermentação foi registrado. O produ- to fermentado foi resfriado através de um trocador de calor de placa, pós-tratado a 23°C – 25°C e suavizado com uma válvula de contra pressão, a uma pressão de 1 bar na saída do refrigerador.
[00113] As amostras foram armazenadas a temperatura ambiente fria (5°C –7°C)
[00114] Amostras armazenadas no dia 7 foram testadas quanto a viscosidade e firmeza em gel, como no Exemplo 1. Os resultados são dados abaixo.
Tabela 11: Avaliação reológica das amostras no dia 7: Homo. Cultura Proteí- Quimosi- Fosfoli- Firm. Visco- Visco- (bar) iniciad. na na (%) pase Gel sidade sidade (%) (G*) a 60 a 300 1/s 1/s 1 150 1 2,50% 0 0,01265 129,22 425,4 97,0 2 300 1 2,50% 0,00026 0,01265 230,46 578,0 110,9 3 150 2 2,50% 0,00026 0,01265 198,86 715,3 150,6 4 300 2 2,50% 0 0,01265 156,17 633,7 168,3 5 150 1 4,50% 0,00046 0,01265 725,84 1559,6 261,2 6 300 1 4,50% 0 0,01265 531,91 1378,3 275,3 7 150 2 4,50% 0 0,01265 527,07 1745,6 375,4 8 300 2 4,50% 0,00046 0,01265 814,83 2255,2 416,2 9 150 1 2,50% 0,00026 0 173,49 441,4 88,1 10 300 1 2,50% 0 0 156,15 454,4 100,1 11 150 2 2,50% 0 0 128,64 538,7 139,1 12 300 2 2,50% 0,00026 0 218,96 726,7 154,6 13 150 1 4,50% 0 0 387,86 1066,2 237,4 14 300 1 4,50% 0,00046 0 779,04 1694,5 292,9 15 150 2 4,50% 0,00046 0 655,44 1816,1 354,5 16 300 2 4,50% 0 0 561,71 1889,3 387,7
[00115] As respostas reológicas foram analisadas utilizando-se uma análise de regressão em etapas, com um modelo multilinear, incluindo efeitos principais e interações de primeira ordem:
[00116] Resposta = cste + a.F1 + b.F2 + c.F3 + d.F4 + e.F5 + f.F1. F2 + g F1. F3...
[00117] Todos os efeitos que tiveram risco de erro acima de 5% (valor P > 0,05) foram eliminados. Viscosidade 60 1/s Sumário do modelo: S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 46,9055 99,78% 99,44% 98,41%
[00118] O modelo explica mais do que 98% da variação experimen-
tal. Coeficientes: Termo Coef. Coef. SE Valor T Valor P Constante 1119,9 11,7 95,50 0,000 Homo. 81,4 11,7 6,94 0,000 Cultura 170,2 11,7 14,51 0,000 Proteína 555,7 11,7 47,39 0,000 Quimosina 103,5 11,7 8,82 0,000 Fosfolipase 41,5 11,7 3,54 0,012 Homo.*Proteína 47,4 11,7 4,04 0,007 Homo.*Fosfolipase -31,5 11,7 -2,68 0,036 Cultura*Proteína 80,8 11,7 6,89 0,000 Proteína*Quimosina 52,3 11,7 4,46 0,004
[00119] Os efeitos de diferentes fatores estão plotados na Figura 2. Viscosidade 300 1/s Sumário do modelo: S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 8,81291 99,64% 99,41% 98,87%
[00120] O modelo explica mais do que 98% da variação experimen- tal. Coeficientes: Termo Coef. Coef. SE Valor T Valor P Constante 225,57 2,20 102,75 0,000 Homo. 12,68 2,20 5,75 0,000 Cultura 42,71 2,20 19,39 0,000 Proteína 99,49 2,20 45,16 0,000 Fosfolipase 6,28 2,20 2,85 0,019 Homo.*Proteína 5,29 2,20 2,40 0,040 Cultura*Proteína 15,67 2,20 7,11 0,000 Os efeitos de diferentes fatores estão plotados na Figura 3.
Firmeza de gel no dia 7: Sumário do modelo: S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 9,66033 99,96% 99,86% 99,38%
[00121] O modelo explica mais do que 99% da variação experimen- tal. Coeficientes: Termo Coef Coef SE Valor T Valor P Constante 398,48 2,42 165,00 0,000 Homo. 32,68 2,42 13,53 0,000 Cultura 9,23 2,42 3,820 0,019 Proteína 224,48 2,42 92,95 0,000 Quimosina 76,14 2,42 31,53 0,000 Fosfolipase 15,82 2,42 6,55 0,003 Homo.*Proteína 16,23 2,42 6,72 0,003 Homo.*Fosfo. -13,63 2,42 -5,64 0,005 Cultura*Proteína 7,57 2,42 3,13 0,035 Cultura*Quimosina -11,82 2,42 -4,90 0,008 Proteína*Quimosina 44,69 2,42 18,50 0,000 Proteína*Fosfo. 11,13 2,42 4,61 0,010
[00122] Como evidenciado cima, o impacto da fosfolipase na textu- ra medida em ambos os pontos de viscosidade foi confirmado com alto nível de significância (valor p = 0,012 e 0,019), mostrando seu efeito positivo tanto no paladar quanto na coesão. O efeito da fosfolipase foi maior em um nível de homogeneização menor (interação negativa sig- nificativa, valor p = 0,036). O ganho máximo de viscosidade é de +145 mPa.s no nível de homogeneização de 150 bar. Não foi observada in- teração com a cultura; a fosfolipase parece funcionar da mesma forma com relação à cinética de fermentação. Não houve interação negativa entre fosfolipase e quimosina, mostrando que seu efeito combinado é puramente aditivo e o ganho máximo pode chegar a +457 mPa.s. Isso confirma que a adição de quimosina é capaz de melhorar ainda mais a textura.
[00123] Efeitos fortes semelhantes e as mesmas conclusões podem ser traçados para a resposta de firmeza do gel. Exemplo 3
[00124] Foi preparado iogurte de soja contendo 2,03% de gordura e 4,05% de proteína. O efeito da fosfolipase nas propriedades reológicas no dia 7 foi avaliado. Tabela 12: Composição utilizada para a preparação de iogurte de soja (% em peso) Ingrediente Especificação Dosagem (%) Soja em pó chinesa Redman 22,50 Açúcar KSL, açúcar refinado 5,00 Água Água da cidade PUB 72,50 Tabela 13: Amostras do Exemplo 3 Amostra Cultura Dosagem Enzima S1 YF-L DA01 200U/MT - S2 YF-L DA01 200U/MT Yieldmax®PL 0,0046% Preparação e Fermentação:
[00125] Dependendo do ajuste, a fosfolipase foi adicionada antes, no início ou durante o período de fermentação.
[00126] O método utilizado no exemplo 3 foi o seguinte. A composi- ção exibida na tabela 12 foi misturada com um misturador Silverson. A temperatura / tempo de hidratação de mistura foi de 45°C - 50°C /20min. A homogeneização foi realizada com um homogeneizador de Laboratório GEA com pré-calor de 65-70°C, sendo a pressão de 150 bar para o 1º estágio e de 50 bar para o 2º estágio, totalizando 200 bar. O processo foi realizado em um banho de água Scandinox, com uma condição de pasteurização de 85°C / 30 min e uma temperatura de resfriamento inferior a 10°C. A fermentação foi realizada no banho de água Scandinox, com temperatura de 43°C e pH final de 4,55 ± 0,05.
[00127] O pós-tratamento para o iogurte de soja foi o seguinte: uma unidade de tratamento piloto (PTU) foi usada com uma contra pressão de 1,0 bar e uma temperatura de resfriamento de 23°C –25°C.
[00128] Os estudos de reologia das amostras obtidas a partir do exemplo 3, foram realizados como segue. Os estudos de reologia fo- ram realizados com um reômetro (Anton Paar Modular Compact Rhe- ometer MCR 302, Anton Paar® GmbH, Áustria). A temperatura de me- dida foi de 13°C e o programa Stirred_oscillation+Up_DownFlow foi utilizado. Tabela 14: Detalhes de fermentação Receita S1 S2 pH final 4.60 4,58 Tempo de fermentação 9 h. 10 min. 9 h. 10 min. pH @ D+7 4,52 4,53 Tabela15: Curva de histerese e oscilação para cada amostra após um período de validade de D+7 dias Oscilação Curva de histerese Validade Amostra G* @ 1,52Hz (Pa) Visc. pt Visc. pt Visc. pt área 1 5 21 D+7 S1 452,43 74453 1178,8 295,65 6396,17 S2 537,42 86539 1342,8 317,83 7145,82 - Visc. pt 1: Viscosidade (mPa.s) a 0.271 1/s (estado inicial, resistência quando uma colher retira o iogurte) - Visc. pt 5: Viscosidade a 60 1/s (bem correlacionada com textura na boca) - Vis pt 21: Viscosidade a 300 1/s (coesão (dificuldade de engolir /espessura na boca) - área de histerese: correlacionada à resistência de cisalhamento - Oscilação G* @ 1,52Hz: correlacionada à firmeza de gel
[00129] Como evidenciado cima para o iogurte de soja, a adição de fosfolipase (YieldMAX®PL) mostrou um efeito positivo na textura do iogurte de soja, com a Visc. pt 5 de S2 sendo 13,9% maior em relação ao S1.
[00130] A avaliação sensorial do iogurte de soja mostrou que o S2 era mais espesso em textura, mais cremoso e menos adstringente no sabor, em comparação com o S1. Assim, a adição de fosfolipase (Yi- eldMAX®PL) melhora a textura e o sabor do iogurte de soja.
Claims (15)
1. Processo para produzir um produto de leite fermentado caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. adicionar uma cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa de bactérias de ácido lático a uma base de leite, b. fermentar a base de leite por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado, e c. adicionar pelo menos uma fosfolipase à base de leite antes, no início ou durante o período de fermentação.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a fosfolipase é adicionada no início do período de fermentação.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a fosfolipase é fosfo- lipase A.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a fosfolipase é fosfo- lipase A1 (EC 3.1.1.32) ou fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4).
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o pH alvo é 4,6 ou mais baixo.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a base de leite é de- finida por um teor de gordura de pelo menos 1,5 % (peso/peso).
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a bactéria de ácido lático é selecionada do grupo consistindo em bactérias dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, e Leuconostoc.
8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cultura iniciadora contém pelo menos uma cepa de
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar uma quimosina (EC 3.4.23.4) à base de leite antes, no início ou durante o período de fermentação.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o produto de leite fermentado é selecionado do grupo consistindo em quark, queijo cre- moso, queijo fresco, leite azedo, leite cultivado, kefir, lassi, ayran, do- ogh, yakult, dahi e iogurte de soja.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a base de leite é homogeneizada a 150 bar ou menos.
12. Produto de leite fermentado caracterizado pelo fato de que é produzido a partir do método de qualquer uma das reivindica- ções precedentes.
13. Produto de leite fermentado de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizado pelo fato de que o produto de leite fermentado tem viscosidade aumentada em comparação a um produto de leite fermentado produzido sem adicionar fosfolipase.
14. Uso da fosfolipase caracterizado pelo fato de que é usado para aumentar a viscosidade de um produto de leite fermenta- do.
15. Kit para produzir produto de leite fermentado, caracteri- zado pelo fato de que compreende pelo menos uma fosfolipase e uma cultura iniciadora.
Tensão de cisalhamento τ [Pa]
Petição 870200083697, de 06/07/2020, pág. 49/65 1/4
Taxa de cisalhamento amostra
Petição 870200083697, de 06/07/2020, pág. 50/65 Meios de viscosidade a 60 1/s Homogeneização Cultura Proteína Quimosina Fosfolipase 2/4
Nível de fator
Petição 870200083697, de 06/07/2020, pág. 51/65 Meios de viscosidade a 300 1/s Homogeneização Cultura Proteína Fosfolipase 3/4
Nível de fator
Taxa de cisalhamento Tensão de cisalhamento τ [Pa]
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