BR112014005253B1 - método de detecção molecular - Google Patents

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Abstract

método de detecção molecular a presente invenção se refere a um método de detecção molecular que compreende tratar uma amostra biológica diretamente com um agente de bissulfito sob condições que permitam ruptura de células e tratamento de ácido nucleico, remover o agente de bissulfito a partir da amostra tratada, e detectar um ácido nucleico alvo na amostra tratada.

Description

DE DETECÇÃO MOLECULAR.
Campo Técnico
A presente invenção se refere a métodos para processamento de amostras para ensaios de detecção molecular, particularmente processamento de amostras clínicas para ensaios de detecção de ácido nucleico para detecção de doença.
Antecedentes da invenção
Teste molecular de seres humanos se tornou cada vez mais importante para diagnóstico médico e controle de pacientes. 0 teste molecular de animais está adquirindo importância em aplicações veterinárias. Teste de ácido nucleico é uma ferramenta essencial para forense moderna, imigração, atribuição de paternidade e outras aplicações de identidade humana. Epigenética está se tornando cada vez mais importante para pesquisa de câncer, identificação de biomarcadores, fatores de predisposição e alvos de droga em potencial. Genotipagem de RNA abrange uma gama de aplicações utilizadas para analisar diferenças genéticas entre indivíduos ou células, em todas as áreas de pesquisa, teste aplicado e diagnóstico. Ao lidar com amostras biológicas, testes moleculares presentes exigem prétratamento específico das amostras antes de realizar
2/31 detecção de ácido nucleico com técnicas como reação de cadeia de polimerase (PCR). O pré-tratamento de amostra é atualmente considerado essencial e muitos kits comerciais e sistemas foram desenvolvidos e estão sendo utilizados no mercado. Infelizmente, o pré-tratamento acrescenta custo a teste molecular e exige equipamento e tempo de processamento adicionais.
Human Genetic Signatures Pty Ltd (Sidney, Austrália) desenvolveu um método para detecção de micro-organismos como revelados em WO 2006/058393 e US 7833942. O método envolve tratar ácido nucleico de micróbio de um microorganismo com um agente para formar uma forma simplificada de ácido nucleico derivado do ácido nucleico de micróbio tendo sequências de ácido nucleico exclusivas que podem ser utilizadas para detectar o micro-organismo.
O presente inventor desenvolveu um ensaio de detecção molecular aperfeiçoado que não exige pré-tratamento de amostra como atualmente exigido em ensaios de detecção molecular.
Resumo da invenção
A presente invenção se refere a um ensaio de detecção molecular realizado em uma amostra biológica sem exigir uma etapa de limpeza de amostra ou processamento da amostra biológica para lisar células ou purificar ácido nucleico.
3/31
Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um ensaio de detecção molecular que compreende:
(a) tratar uma amostra biológica diretamente com um agente de bissulfito sob condições que permitam ruptura de células e tratamento de ácido nucleico;
(b) remover o agente de bissulfito a partir da amostra tratada; e (c) detectar um ácido nucleico alvo na amostra tratada.
A amostra biológica exige ruptura de células ou tratamento químico/físico antes da etapa (a).
A amostra biológica pode ser selecionada de fezes, nasal, sangue, plasma, soro, células bucais, pus, ferimento, filtrados concentrados, fluido cerebrospinal, sêmen, citologia baseada em líquido (LBC), tecido, FFPE, células capturadas a laser, células cultivadas, células peletizadas, culturas bacterianas, colônias bacterianas, suspensão viral, aspirado, lavagem bronquial, amostra de esputo, amostra ambiental, concentrado ambiental, gênero alimentício, ingrediente bruto, amostra de água ou concentrado de água e similar.
O ácido nucleico detectado pode ser DNA, RNA ou combinações tanto de DNA como RNA.
ensaio é adequado para detectar doença infecciosa,
4/31 doença genética ou traço genético em um animal. Preferivelmente, o animal é um ser humano.
A doença infecciosa pode ser causada por um microorganismo incluindo bactérias, vírus, viroide, levedura, fungos, príon, parasitas ou amebas.
A doença genética pode ser câncer, mutação, variação de número de cópia, distúrbio herdado, doença induzida ambientalmente, doença causada por exposição a carcinógenos, doença caracterizada por expansão ou redução em uma extensão de repetição de nucleotídeo em um genoma.
traço genético pode ser suscetibilidade a câncer ou qualquer outra doença onde alterações epigenéticas e genéticas contribuem para o desenvolvimento de um estado de doença.
Preferivelmente o agente de bissulfito é bissulfito de sódio ou metabissulfito de sódio. 0 agente de bissulfito é preferivelmente utilizado em uma concentração de aproximadamente 2,5 M a aproximadamente 3,5 M tendo uma faixa de pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5. Mais preferivelmente, o agente de bissulfito é utilizado em uma concentração de aproximadamente 3 M em um pH de aproximadamente 5,0.
Preferivelmente, a etapa (a) envolve aquecimento entre aproximadamente 75°C e 95 °C por aproximadamente 1 minuto a
5/31 minutos. Mais preferivelmente, a amostra é aquecida por aproximadamente 10 a 20 minutos em uma temperatura entre aproximadamente 80°C e 95 °C. Será reconhecido que a temperatura e duração de aquecimento podem variar dependendo da amostra sendo tratada e a fonte celular do ácido nucleico a ser detectado.
O bissulfito pode ser removido da amostra tratada por qualquer meio apropriado. Os exemplos incluem purificação baseada em coluna ou purificação baseada em conta são ótimas, porém em alguns casos uma etapa de precipitação simples pode ser suficiente.
Após remoção do bissulfito, a amostra é preferivelmente ressuspensa em tampão de eluição que tem um pH de pelo menos 10, mais preferivelmente entre aproximadamente pH 11,5 e aproximadamente 12,5. Verificouse que um pH de pelo menos aproximadamente 12 é apropriado para a maioria das amostras.
O agente de bissulfito modifica citosina para uracila em ácido nucleico tratado. Em DNA de fita dupla, o agente de bissulfito modifica citosina para uracila em cada fita de DNA genômico de fita dupla complementar formando duas moléculas de ácido nucleico derivados, porém não complementares.
Em uma forma preferida, o ácido nucleico microbiano
6/31
derivado contém substancialmente bases de adenina (A) ,
guanina (G) , timina (T) e uraci la (U) e tem
substancialmente o mesmo número total de bases que o ácido
nucleico não tratado correspondente.
Se o ácido nucleico tratado for amplificado, então o ácido nucleico amplificado contém substancialmente as bases adenina (A) , guanina (G) e timina (T) . A amplificação pode ser realizada por qualquer meio apropriado como reação de cadeia de polimerase (PCR), amplificação isotérmica, ou amplificação de sinal.
Em uma forma preferida, o ensaio inclui ainda fornecer iniciadores de ácido nucleico ou sondas para a amostra tratada.
Preferivelmente, a amostra tratada é submetida a uma reação de amplificação para formar uma molécula de ácido nucleico alvo específica para o indicador genético ou micro-organismo.
A molécula de ácido nucleico alvo é preferivelmente detectada por amplificação. Exemplos de detecção de amplificação apropriada incluem PCR, qPCR, PCR de transcriptase inversa, PCR digital, amplificação isotérmica ou amplificação de sinal.
O ácido nucleico tratado também pode ser detectado por um método de sequenciamento como Roche 454, ABI SOLiD ou
7/31 sistemas de torrente de íon, tecnologia Illumina Hi Seq SBS, Helicos Heliscope ou tecnologia SMRT empregada por Pacific Biosciences ou qualquer tecnologia equivalente.
Em uma forma preferida, a molécula de ácido nucleico alvo é detectada por:
fornecer um ligante de detector capaz de ligar-se a uma região alvo da molécula de ácido nucleico específica de microbiano e permitir tempo suficiente para o ligante de detector ligar-se à região alvo; e medir ligação do ligante de detector à região alvo para detectar a presença da molécula de ácido nucleico específica de microbiano.
Em outra forma preferida, a molécula de ácido nucleico alvo é detectada por separar um produto de amplificação e visualizar o produto separado. Preferivelmente, o produto de amplificação é separado por eletroforese e detectado por visualizar uma ou mais faixas em um gel.
Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico alvo não ocorre naturalmente em uma célula.
Em um segundo aspecto, a presente invenção provê um kit para um ensaio de detecção molecular para tratamento direto de uma amostra, o kit compreendendo:
um reagente de bissulfito;
reagentes de reação e eluição de ácido nucleico;
8/31 iniciadores de PCR para o ácido nucleico alvo; e instruções para realizar o ensaio.
O kit pode incluir ainda colunas de purificação ou separação de ácido nucleico, mistura mestre PCR, reagentes para PCR, iniciadores de ácido nucleico de controle, tubos de reação, tubos de teste, chumaços, e similares.
Em todo esse relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outro modo, a palavra compreendem, ou variações como compreende ou compreendendo, será entendida como indicando a inclusão de um elemento mencionado, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, porém não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.
Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foi incluída no presente relatório descritivo é exclusivamente para fins de fornecer um contexto para a presente invenção. Não deve ser tomado como uma admissão de que todos ou quaisquer desses assuntos formam componente da base da técnica anterior ou eram conhecimento geral comum no campo relevante à presente invenção como existia na Austrália antes do desenvolvimento da presente invenção.
Para que a presente invenção possa ser mais claramente
9/31 entendida, modalidades preferidas serão descritas com referência aos seguintes desenhos e exemplos.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 mostra resultados de detecção de C. difficile utilizando a presente invenção. A. o canal Fam é específico para os genes tcdA/B de C. difficile; Β. o canal Cy5 é específico para o controle de extração.
A figura 2 mostra resultados de amplificação dos três vírus a partir da mesma amostra. A. Fam = norovirus (vírus de RNA de fita única); B. Hex = adenovirus (vírus de DNA de fita dupla; C. Cy5 = rotavirus (vírus de RNA de fita única.
A figura 3 mostra o efeito de reforçar células humanas em material fecal. A. mostra células MRC5 humanas aquecidas por 15 minutos em reagente de bissulfito 3M a 95°C a seguir suspensas novamente em tampão de pH elevado (12,3) e amplificados para o gene B-globina humano. B. mostra as mesmas células reforçadas em material fecal aquecida por 15 minutos em reagente de bissulfito 3M a 95 °C a seguir suspensas novamente em tampão de pH elevado (12,3) e amplificadas para o gene β-globina humano.
Modo(s) para Realizar a Invenção
Vantagens
A presente invenção tem muitas vantagens em relação aos métodos da técnica anterior incluindo o seguinte:
10/31
a. Lise da célula e conversão de ácido nucleico da amostra ocorre simultaneamente no mesmo tubo e lise completa e conversão podem ser obtidas em menos de 30 minutos, e mesmo podem ser obtidas por pouco quanto 10 a 20 minutos.
b. Amostras como material fecal podem ser diretamente processadas sem perda de sensibilidade.
c. Testes baseados na presente invenção têm uma vantagem de serem capazes de serem realizados em uma amostra de paciente primária sem pré-tratamento com enzimas como proteinase K.
d. O método não exige nenhum método de purificação caro como kits de purificação comercial atualmente no mercado. Esses kits comerciais são disponíveis para aproximadamente todo tipo de amostra como sangue, fezes, células cultivadas, FFPE, bactérias, vírus e parasitas citando apenas alguns. Esses kits comerciais podem custar milhares de dólares e pode demorar 2 a 4 horas para purificar uma amostra. Aproximadamente todo laboratório no mundo utiliza esses kits para purificação de amostra antes de qualquer etapa de amplificação subsequente em ensaios moleculares atualmente empregados.
e. Após remoção do bissulfeto a amostra é então suspensa novamente em um tampão de eluição simples que não
11/31 exige nenhum tratamento adicional como dessulfonação de calor, desse modo simplificando o processo.
f. O método pode simultaneamente detectar os vírus tanto de RNA como DNA no mesmo tubo a partir da mesma amostra sem nenhuma necessidade de utilizar um kit de purificação viral especializado. Os vírus tanto de RNA como DNA (embora um seja de fita única e um seja de fita dupla) são lisados e convertidos com eficiência igual pela presente invenção.
g. Surpreendentemente o tampão de eluição, que está em pH elevado, não degrada RNA. Essa descoberta vai contra o que foi ensinado na técnica anterior visto que o ensinamento da técnica anterior especificamente informa contra o tratamento de RNA tanto em temperaturas como pH elevados.
h. 0 método pode lisar e converter todos os tipos de bactérias utilizando condições similares desse modo uma única amostra de paciente pode ser utilizada para múltiplos testes para C. difficile, Salmonella, Camplylobacter e parasitas, etc., desse modo removendo o problema de um método de extração separado para cada bactéria ou microorganismo alvo.
i. 0 método é aplicável em amostras difíceis de lisar como parasitas, que podem formar invólucros externos
12/31 duros que os tornam resistentes a técnicas de lise convencionais. Desse modo, organismos alvo como Mycobacterium tuberculosis (TB) (muito resistente a técnicas de lise convencionais) seriam ideais para detectar, visto que testes de diagnóstico baseado em ácido nucleico são exigidos.
j. 0 método é capaz de lisar eficientemente e converter vírus de hepatite C (HCV) diretamente a partir do soro utilizando pouco quanto 10 cópias do vírus demonstrando a utilidade para detectar vírus de RNA importantes em um nível muito baixo.
k. O método também reduz tempo de processamento de amostra em muitas horas e remove o problema de que a amostra tinha de ser purificada, a seguir convertida com bissulfito e purificada novamente como atualmente realizado.
l. O método é apropriado para a detecção sensível de câncer colorretal em material fecal de pacientes. Tais amostras são não invasivas e reduziríam a confiança sobre endoscopia como o meio primário de detecção. Além disso, uma amostra para resultar seria esperada em menos de três horas sem procedimentos de processamento de amostra complexos. O uso de material fecal sobre amostras de soro para diagnóstico tem muitas vantagens, a mais significativa
13/31 é que um número elevado de células humanas é provável de estar presente na amostra, ao contrário de amostras de soro onde sensibilidade é sempre um problema principal.
Amostras
A presente invenção é apropriada para processar amostras incluindo fecal, nasal, sangue, plasma, células bucais, pus, ferimento, filtrados concentrados, fluido cerebrospinal, sêmen, citologia baseada em líquido (LBC), tecido, FFPE, células capturadas a laser, células cultivadas, células peletizadas, culturas bacterianas, colônias bacterianas, suspensão viral, aspirado, lavagem bronquial, amostra de esputo, amostra ambiental, concentrado ambiental, gênero alimentício, ingrediente bruto, amostra de água, concentrado de água ou similar.
Tratamento de amostra (HGS)
Um método preferido de tratar uma amostra de acordo com a presente invenção é como a seguir. A amostra é colocada diretamente em 200 μΐ de 3 M (faixa 2,5 a 3,5 M) de bissulfito de sódio pH 5,0 (faixa de pH 4,5 a 5,5) e aquecido entre 75°C e 95°C entre 10 e 20 minutos.
O bissulfito é removido da amostra tratada por qualquer meio apropriado. Os exemplos incluem purificação baseada em coluna ou purificação baseada em conta são ótimos, porém em alguns casos uma etapa de precipitação
14/31 simples pode ser suficiente.
Após remoção do bissulfito, a amostra é suspensa novamente em tampão de eluição que tem um pH entre 11,5 a 12,5 (>pH 12 preferido).
A amostra está agora pronta para amplificação de PCR sem processamento adicional.
Remoção de bissulfito
A remoção de bissulfito pode ser utilizada obtida por um método comercialmente disponível como técnica MethylEasy™ (Human Genetic Signatures) . Em resumo, 24 0 μΐ de reagente no. 3 são adicionados à amostra e a amostra transferida para uma coluna de centrífuga. A coluna é então girada a 10.000 xg para remover o bissulfito. A coluna é então lavada x2 com 3 00 μΐ de reagente no. 4 girando a 10.000 xg entre lavagens. 20 a 50 μΐ de tampão de eluição são adicionados e a amostra girada em um tubo de coleta limpo. A amostra está agora pronta para amplificação PCR.
Pré-tratamento de amostra
O pré-tratamento de amostra atual envolve kits comerciais vendidos por Qiagen Inc (Valencia, CA 91355 EUA), Sigma Life Sciences (St. Louis, MO, EUA), Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA 92008, EUA) e Promega Corporation (Madison, WI 53711 EUA).
15/31
A presente invenção foi comparada com os seguintes métodos.
Teste de hospital in-house
Uma amostra de fezes foi aquecida a 95 °C por 10 minutos a seguir diluída e a amostra então amplificada para o gene tcdB de C. difficile.
Purificação de Qiagen
Mini kit de fezes de DNA QiAmp (50) Cat. N.° 51504.
Teste de parasita comercial
Parasitas gastrointestinais AusDiagnostics 5, catálogo número 6502.
RESULTADOS
Amostras de fezes
Todas as amostras fecais testadas nas Tabelas 1, 2, 3 e 4 foram tratadas como a seguir:
Um chumaço foi colocado em material fecal e a seguir transferido para um tubo contendo 200 μΐ de 3 M bissulfito de sódio pH 5,0 misturado e então aquecido a 95°C por 15 minutos.
Bissulfito foi removido utilizando o método MethylEasy™ e as amostras foram suspensas novamente em 20 a 50 μΐ de tampão de eluição a seguir amplificados utilizando condições padrão.
16/31
A Tabela 1 mostra os resultados de um teste de hospital in-house, as mesmas amostras testadas utilizando purificação Qiagen e as mesmas amostras utilizando o método de acordo com a presente invenção. Como pode ser visto a partir dos resultados o teste de hospital in-house resultou em 7 resultados falsos negativos e 1 resultado falso positivo (confirmados por EIA e cultura bem como um kit de diagnóstico molecular comercialmente disponível) indicando que o método não teve a sensibilidade exigida para a detecção de C. difficile em amostras de pacientes primárias. Utilizando o método Qiagen, 4 amostras não tiveram material suficiente para processamento enquanto 1 amostra forneceu um resultado falso negativo (GDH positivo por EIA). Esses resultados demonstram a utilidade do método de acordo com a presente invenção (método HGS) para o diagnóstico rápido de C. difficile. Além disso, as amostras que têm volumes limitados são facilmente ensaiadas utilizando o método HGS. Além disso, o método Qiagen requer pelo menos 2 horas de tempo de preparo de amostra e tendo de pesar quantidades predeterminadas de material fecal.
Tabela 1. Resultados do teste de hospital in-house vs. Purificação Qiagen vs método HGS para a detecção C. difficile.
17/31
In- In-
amostra# house Qlagen HGS amostra# house Qiagen HGS
1 NEG NEG NEG 24 NEG POS POS
2 POS POS POS 25 POS INSUF POS
3 NEG NEG POS 26 NEG NEG NEG
4 POS POS POS 27 NEG POS POS
5 POS POS POS 28 NEG NEG NEG
6 NEG NEG NEG 29 NEG NEG NEG
7 POS POS POS 30 NEG NEG NEG
8 NEG POS POS 31 POS INSUF POS
9 NEG NEG NEG 32 POS POS POS
10 NEG NEG NEG 33 NEG NEG NEG
11 NEG NEG NEG 34 NEG NEG NEG
12 NEG POS POS 35 NEG NEG NEG
13 NEG NEG NEG 36 NEG NEG NEG
14 NEG NEG NEG 37 NEG NEG NEG
15 POS NEG NEG 38 NEG POS POS
16 NEG NEG NEG 39 POS POS POS
17 NEG NEG NEG 40 POS POS POS
18 NEG INSUF NEG 41 POS POS POS
19 NEG NEG NEG 42 POS POS POS
20 NEG POS POS 43 POS INSUF POS
21 POS POS POS 44 NEG NEG NEG
22 POS POS POS 45 NEG NEG NEG
23 NEG NEG NEG
Tabela 2. Resultados da microscopia padrão vs kit de
detecção de parasita comercialmente disponível vs método
HGS.
Amostra# Parasita detectado Parasitas gastrointestinais EasyPlex 5 HGS Outros resultados clínicos
1 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
2 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
3 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
4 Cryptosporidium spp. Negativo Cryptosporidium spp
5 Cryptosporidium SPP· Negativo Cryptosporidium spp
6 Cryptosporidium spp. Negativo Cryptosporidium spp
7 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
8 Giardia Negativo Giardia intestinalis
18/31
intestinalis
9 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
10 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp e Entamoeba
11 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp.
12 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp.
13 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis e Entamoeba
14 Giardia intestinalis Cryptosporidium spp. Giardia intestinalis e Entamoeba
15 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis e Entamoeba
16 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
17 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
18 D.fragilis, G.lamblia Cryptosporidium spp. Giardia intestinalis, Dientamoeba e Salmonella spp. Salmonella Isolada
19 Giardia intestinalis Giardia Giardia intestinalis
20 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
21 Giardia intestinalis Cryptosporidium spp. Giardia intestinalis
22 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp.
23 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis, Dientamoeba e Campy C. jejuni Isolada
24 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
25 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
26 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
27 NPI Negativo Negativo
28 NPI Negativo Negativo
29 NPI Negativo Negativo
30 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosoridium spp. e Shigella Sem Shigella Isolada
31 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. e Shigella Sem Shigella Isolada
32 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. e Shigella Sem Shigella Isolada
33 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. e Shigella Sem Shigella Isolada
34 Cryptosporidium Cryptosporidium Cryptosporidium spp. Sem
19/31
SPP- spp. e Shigella Shigella Isolada
35 Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp.
36 Giardia intestinalis Giardia Giardia intestinalis, Entamoeba, Shigella Shigella spp também isolada
37 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
38 Giardia intestinalis Giardia Giardia intestinalis, Entamoeba, Shigella Shigella spp também isolada
39 Giardia intestinalis Giardia Giardia intestinalis, Entamoeba, Shigella Shigella spp também isolada
40 NPI Negativo Negativo
41 NPI Negativo Giardia intestinalis
42 NPI Negativo Negativo
43 NPI Negativo Giardia intestinalis
44 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
45 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
46 NPI Negativo Giardia intestinalis
47 NPI Negativo Giardia intestinalis
48 NPI Negativo Giardia intestinalis
49 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
50 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
51 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
52 NPI Negativo Salmonella spp Não Cultivado
53 Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
54 Giardia intestinalis Giardia Giagiardia intestinalis não
Todas as amostras destacadas pertencem ao mesmo paciente.
A Tabela 2 mostra os resultados de uma comparação direta da microscopia padrão, um teste de parasita comercial (Ausdiagnostic Easy-Plex parasita gastrointestinal 5) e o método HGS. Como pode ser visto a
20/31 partir dos resultados, o método comercial é incapaz de lisar muitas das amostras que contêm os cistos de Giardia. Isso está em contraste com o método HGS que facilmente detecta todas as amostras de Giardia e também algumas amostras que são perdidas por microscopia convencional. Além disso, o método HGS parece ser universal para a lise de bactérias e parasitas semelhantes visto que um número de amostras continha tanto parasitas como bactérias, os resultados que foram subsequentemente confirmados pelo hospital.
A Tabela 3 mostra os resultados do método HGS vs métodos de cultura convencionais para detecção microbiana. Como pode ser visto o método de falhou em detectar uma amostra que continha A Campylobacter spp que o método molecular detectou. Além disso, nenhuma reatividade cruzada foi detectada com amostras que continham C. difficile. Todos os resultados de cultura positivos concordaram com o método HGS indicando a sensibilidade aperfeiçoada de métodos moleculares em comparação com cultura convencional. Além disso, os resultados do método HGS são disponíveis em tão pouco quanto 3 horas em comparação com culturas durante a noite exigidas para métodos de cultura convencionais.
Tabela 3. Resultados de métodos de cultura convencionais para a detecção de método bacteriano entérico
21/31 vs HGS
Amostra Cultura Campy Salmão Amostra Cultura Campy Salmão
A01 Salmão N/D 23,77 A23 Campy 32,57 N/D
A02 NPI N/D N/D A24 Salmão N/D 30,98
A03 Salmão N/D 29,7 A25 Campy 31,18 N/D
AO 4 Salmão N/D 26,06 A26 Salmão N/D 45,32
A05 Campy 39,18 N/D A27 Campy 41,49 N/D
AO 6 Campy 44,37 N/D A28 Campy 38,69 N/D
A07 Campy 39,88 N/D A2 9 Campy 38,36 N/D
AO 8 Salmão N/D 39,83 A3 0 Salmão N/D 38,3
AO 9 CD N/D N/D A31 CD N/D N/D
A10 Campy 35,39 N/D A3 2 Salmão N/D 35,76
All NPI 36,09 N/D A3 3 Campy 35,61 N/D
A12 Campy 35,72 N/D A3 4 CD N/D N/D
Al 3 Salmão N/D 30,21 A3 5 Campy 36,12 N/D
Al 4 Salmão N/D 30,24 A3 6 Campy 39,96 N/D
A15 Campy 40,05 N/D A3 7 Salmão N/D 37,53
Al 6 Salmão N/D 27,06 A3 8 Campy 46,2 N/D
A17 Campy 36,26 N/D A3 9 Campy 35,96 N/D
A18 Campy 44,81 N/D A4 0 Campy 47,31 N/D
Al 9 Campy 26,57 N/D A41 Salmão N/D 30,3
A2 0 Campy 29,8 N/D A42 Salmão N/D 37,14
A21 Salmão N/D 26,58 A43 CD N/D N/D
A22 Campy 34,78 N/D
Condições de tratamento
Quatro amostras de fezes, 3 positivas para C.
difficile e 1 negativa para C. difficile foram ensaiadas para determinar o efeito de temperatura e tempo sobre a eficiência de extração. Um controle de extração (gene 16s rDNA) foi também incluído para determinar o efeito de condições na flora misturada que está presente em amostras de fezes. 0 canal Fam é específico para os genes tcdA/B de C. difficile enquanto o canal Cy5 é específico para o controle de extração. Os resultados são mostrados na figura
22/31 e Tabela 4.
Como pode ser visto a partir dos resultados na Tabela 4 e tempos e temperatura preferida para lise dessas amostras situam-se entre 85°C e 95°C por 15 minutos. Todas as amostras positivas e flora fecal foram facilmente detectadas.
Tabela 4. O efeito de tempo e temperatura sobre a eficiência do método de conversão/lise HGS utilizando amostras de fezes
23/31
10mln/85C 15min/85’C 20min/85°C
Amostra 1 tcdA/B 44.73 ExCon 34.54 tcdA/B 40.46 ExCon 31.91 tcdA/B 39.1 ExCon 5 31.08
Amostra 2 41.57 35.09 41.59 30.31 40.23 29.09
Amostra 3 N/A 32.76 N/A 28.15 N/A 27.25
Amostra 4 42.6 30.19 N/A 30.26 46.22 28.91
10min/90°C 15 mÍn/90’C 20min/90°C
tcdA/B ExCon tcdA/B ExCon tcdA/B ExCon
Amostra 1 41.66 32.17 39.63 30.39 39.88 30.73
Amostra 2 41.19 29.05 41.25 27.53 41.33 25.17
Amostra 3 N/A N/A N/A 27.31 N/A 26$
Amostra 4 42.63 28.69 43.88 27.27 N/A 27.86
10 mln/95°C 15 mln/95°C 20 min/95*C
tcdA/B ExCon tcdA/B ExCon tcdA/B ExCon
Amostra 1 40.48 30.82 39.53 31.52 39.52 29/o4
Amostra 2 40.38 26.41 40.3 26.31 42.21 30.52
Amostra 3 N/A 27.08 N/A · 27.47 N/A 37.35
Amostra 4 41.93 27.64 40.31 27.76 42.2 26.66
Tabela 5. O efeito de pH de tampão de eluição sobre a capacidade do método em detector eficientemente HCV diretamente a partir das amostras de soro.
7 0°C 75°C 80°C 90°C
5 min 10 min 15 min 5 min 10 min 15 min 5 min 10 min 15 min 5 min 10 min 1! m:
PCR-ApH 11,5 N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N,
24/31
PCR-ApH 12,5 N/D 36,83 36,01 N/D 33,27 34,8 36,88 33,02 N/D 34,45 34,22 3:
PCR-BpH 11,5 N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N,
PCR-BpH 12,5 N/D 39,34 37,17 N/D 35,76 36,2 40,98 35,05 N/D 36,21 36,48 3!
μΐ de HCV (Acrometrix) foram adicionados a 200 μΐ de 3 M bissulfito de sódio e aquecidos a 75°C, 75°C, 80°C e 90°C por 5, 10 ou 15 minutos. Bissulfito foi removido utilizando um método MethylEasy™ modificado e as amostras foram suspensas novamente em 20 μΐ de tampão de eluição, 12 μΐ de transcrito inverso a seguir 2 μΐ amplificado utilizando condições padrão.
Como pode ser visto a partir dos resultados da Tabela 5 HCV RNA pode resistir facilmente conversão de lise a 90 °C, a temperatura mais elevada testada. Ainda mais surpreendentemente o ensaio funcionou para detecção de vírus de RNA na presença do tampão de pH elevado, que é contrário à literatura publicada indicando que a espécie de RNA necessita ser mantida em torno de pH neutro.
Esses resultados combinados com os resultados na Tabela 4 sugerem que uma temperatura em torno de 90°C por 15 minutos poderia ser um método de processamento de amostra universal para organismos contendo DNA de fita dupla como C. difficile e vírus de RNA de fita única como HCV. Além disso, como C. difficile é um organismo contendo
25/31 espório os resultados indicam que o método é severo o suficiente para abrir espórios duros, porém suave o suficiente de modo que vírus contendo RNA não sejam degradados. Novamente tais dados não teriam sido previstos pela técnica anterior.
etectada por amplificação.ra mestre utilizada (JumpStart (Sigma) e FastStart (Roche) respectivamente).
Soro
Diluições de HCV (Zeptoometrix) foram preparadas a seguir 10 ul de cada diluição adicionada a 200 ul de 3 M bissulfito de sódio e aquecida a 75°C por 10 minutos.
Bissulfito foi removido utilizando o método
MethylEasy™ e as amostras foram suspensas novamente em 20 μΐ de tampão de eluição, 12 μΐ de transcrito inverso a seguir 2 μΐ amplificado utilizando condições padrão.
Tabela 6. Detecção sensível de vírus HCV diretamente a partir do soro.
HCV/PCR IU/PCR Positivo l\10 200 32,5434,41 l\100 20 37,0738,32
1\1000 2 37,5438,63
1\10000 0,2 N/D N/D
1/100000 0,02 N/D N/D
Processo N/D N/D
Como pode ser visto a partir tabela 6 ao utilizar o método HGS para processar o soro diretamente tão pouco quanto 2 IU de HCV podem ser eficientemente lisado e
26/31 convertido simultaneamente. Esses resultados demonstram a excelente sensibilidade que pode ser gerada utilizando vírus de RNA como alvo para o processo.
Tabela 7 lise/conversão simultânea tanto de vírus RNA como vírus DNA sob condições de extração idênticas.
A figura 2 mostra amplificação dos três vírus a partir da mesma amostra.
A. Fam = norovirus (vírus de RNA de fita única)
B. Hex = adenovirus (vírus de DNA de fita dupla)
C. Cy5 = rotavirus (vírus de RNA de fita única)
Amostras qualitativas de Norovirus, Adenovirus e Rotavirus foram obtidas de Zeptometrix. Amostras de cada vírus (10 μΐ) foram adicionadas a 3 M bissulfito de sódio e as amostras aquecidas a 90°C por 10, 15 e 20 minutos. O bissulfito foi então removido utilizando um método MethylEasy™ modificado e as amostras foram suspensas novamente em 20 ul de tampão de eluição, 12 μΐ transcrito inverso a seguir 2 μΐ amplificado utilizando condições padrão.
Como pode ser visto a partir da Tabela 7 após 15 minutos de aquecimento a 90°C os vírus tanto de RNA como DNA são eficientemente lisados e convertidos. Os dois tipos de vírus foram purificados sob condições idênticas. Esses resultados demonstram ainda a utilidade do método HGS como
27/31 um método de preparação de amostra universal para o lise e conversão eficiente dos vírus tanto DNA como RNA a partir da mesma amostra. Novamente surpreendentemente os vírus de RNA podem resistir facilmente ao tratamento de amostra de 90°C e tampão de pH elevado.
Tabela 7. Lise/conversão simultânea tanto de vírus
RNA como vírus DNA sob condições de extração idênticas.
Fam Norovirus Hex Adenovirus Cy5 Rotavirus
10 min 15 min 20 min PC 10 min 15 min 20 min PC 10 min 15 min 20 min PC
Limpo 31,75 29,67 30,09 N/D 36,32 32,36 36,37 N/D 34,5 32,13 37,35 N/I
l\10 35,61 33,25 31,96 N/D N/D 36,45 N/D N/D 40,04 34,5 38,6 N/I
l\100 40,51 38,87 35,84 N/D N/D 44,67 N/D N/D 39,32 38,57 N/D N/I
Amostras fecais foram reforçadas com amostras qualitativas de Norovirus, adenovirus e Rotavirus obtidas de Zeptometrix. As amostras de vírus (10 μΐ) foram reforçadas em material fecal e a amostra misturada. Um chumaço foi colocado em material fecal e então transferido para um tubo contendo 200 μΐ de 3M bissulfito de sódio pH 5,0 e então aquecido a 90°C por 15 minutos.
Bissulfito foi removido utilizando um método MethylEasy™ modificado e as amostras foram suspensas novamente em 20 μΐ de tampão de eluição, 12 μΐ transcrito inverso a seguir 2 μΐ amplificado utilizando condições
28/31 padrão.
Tabela 8 o efeito de amostras fecais de reforço com vírus
Norovirus Adenovirus Rotavirus Processo
Reforço Adenovirus de N/A 41,1 N/A N/A
Reforço Norovirus de 39,45 N/A N/A N/A
Reforço Rotavirus de N/A N/A 39,62 N/A
Os resultados da tabela 8 mostram que mesmo quando partículas virais são reforçadas em amostras fecais e a condição universal aplicada tanto os vírus de DNA como de FRNA são efetivamente lisados e convertidos. Desse modo, o método deve ser aplicável a qualquer tipo de amostra para qualquer micro-organismo de interesse.
Células humanas
Para determinar se a presente invenção também é apropriada para detecção de doença humana como câncer, 5 ul, 10 ul e 20 ul de células humanas diluídas foram incubados por 10 minutos ou 15 minutos a 70°C, 80°C, 90°C e 95°C em 200 ul de 3M bissulfito. As amostras foram processadas para remover a solução de bissulfito e suspensas novamente em 50 μΐ de tampão pH 12,3. O material (2 μΐ) foi então amplificado utilizando iniciadores e sondas específicas para o gene B-globin humano. Os
29/31 resultados são mostrados na tabela 9 e figura 3.
Tabela 9. Otimização de tempo/temperatura utilizando células MRC5 humanas
70°C 80°C 90°C 95°C
10 min 15 min 10 min 15 min 10 min 15 min 10 min 15 min
Células 5 ul N/A N/A 42,15 43,63 38,62 33,19 ND ND
Células 10 ul N/A N/A 40,72 36,45 35,04 33,31 37,11 33,8
Células 20 ul N/A N/A 45,08 37,03 36,38 32,49 ND ND
ND = não feito.
Como pode ser visto a partir da Tabela 9 o tempo e temperatura preferidos para lise e conversão simultânea de células humanas sem pré-tratamento situa-se entre 90-95°C por 15 minutos.
A figura 3 mostra o efeito de reforçar células humanas em material fecal. A figura 3A mostra células MRC5 humanas aquecidas por 15 minutos em 3M reagente de bissulfito a 95°C a seguir suspensas novamente em tampão de pH elevado (12,3) e amplificadas para o gene B-globin humano. A figura 3B mostra as mesmas células reforçadas em material fecal aquecido por 15 minutos em 3M reagente de bissulfito a 95°C a seguir suspensas novamente em tampão de pH elevado (12,3) e amplificadas para o gene β-globina humano. Como pode ser visto a partir dos resultados células humanas podem ser lisadas e eficientemente convertidas em material fecal humano primário sem qualquer necessidade de pré30/31 processamento de amostra ou isolamento de DNA.
Os resultados indicam que perfilhamento de metilação de células humanas pode ser realizado diretamente em amostras fecais obtidas de paciente sem a necessidade de pré-tratamento ou purificação de amostra antes do bissulfito. Desse modo, o método seria ideal como um método simples e não invasivo para o diagnóstico de câncer colorretal diretamente a partir do material de paciente primário.
Kits de teste de diagnóstico
A presente invenção pode ser fornecida na forma de kits de diagnóstico para permitir facilidade de uso em um laboratório de diagnóstico ou similar. A tabela 10 e tabela 11 mostram os reagentes fornecidos em um kit de teste típico para um micro-organismo, por exemplo. Um kit inclui instruções para uso. Será reconhecido que tubos, chumaços e outro equipamento de laboratório podem não ser fornecidos em um kit visto que esses materiais são normalmente facilmente disponíveis em um laboratório de diagnóstico.
Tabela 10. Caixa 1 de 2 (armazenar em temperatura ambiente)
Nome do Componente conteúdo
Reagente 1 (água alcalina) 5 X 5 mL
Reagente 2 (bissulfito) 5 x 3,5 g
Reagente 3 (reagente de ligação) 5 x 5,8 mL
Reagente 4 (tampão de 5 x 3 mL
31/31
Nome do Componente conteúdo
lavagem)
Reagente 5 (tampão de eluição) 5x3 mL
Chumaços revestidos 100
Tubos revestidos (1,5 mL) 100
Tubos de lavagem 100
Tubos de coleta (1,5 mL) 100
Colunas de purificação 100
Guia de usuário detalhado 1
Tabela 11. Caixa 2 de 2 (armazenar em -20°C após recebimento)
Mistura mestre de PCR 5 x frascos
Componentes de PCR 5 x frascos
A caixa 2 deve ser armazenada a -20°C em uma sala limpa de DNA em um local diferente de onde as amostras serão processadas.
Kits para micro-organismos específicos ou testes genéticos incluem iniciadores de PCR para permitir amplificação da molécula de ácido nucleico alvo.
Será reconhecido por pessoas versadas na técnica que inúmeras variações e/ou modificações podem ser feitas na invenção como mostrado nas modalidades específicas sem se afastar do espírito ou escopo da invenção como amplamente descrito. As presentes modalidades devem ser, portanto, consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de detecção molecular caracterizado pelo fato de que compreende:
    tratar uma amostra biológica diretamente com um agente de bissulfito selecionado dentre bissulfito de sódio ou metabissulfito de sódio a uma concentração de 2,5M a 3,5M e uma faixa de pH de 4,5 a 5,5;
    aquecer entre 75 °C e 95 °C por 1 a 30 minutos para permitir a ruptura de células e tratamento de ácido nucleico;
    remover o agente de bissulfito da amostra tratada; e detectar um ácido nucleico alvo na amostra tratada;
    em que o ensaio é realizado sem o pré-tratamento da amostra biológica antes do tratamento com o agente de bissulfito.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é selecionada de fezes, nasal, sangue, plasma, soro, células bucais, pus, ferimento, filtrados concentrados, fluido cerebrospinal, sêmen, citologia baseada em líquido (LBC), tecido, FFPE, células capturadas a laser, células cultivadas, células peletizadas, culturas bacterianas, colônias bacterianas, suspensão viral, aspirado, lavagem bronquial, amostra de esputo, amostra ambiental, concentrado ambiental, gênero alimentício, ingrediente
    Petição 870190071899, de 26/07/2019, pág. 10/13
    2/4 bruto, amostra de água ou concentrado de água.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para detectar doença infecciosa, doença genética ou traço genético em um animal.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a doença infecciosa é causada por um micro-organismo.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é bactéria, vírus, viroide, levedura, fungo, parasita ou ameba.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a doença genética é câncer, uma doença associada à variação de número de cópia, distúrbio herdado, doença induzida ambientalmente, doença causada por exposição a carcinógenos, doença que possui a característica de expansão ou redução em uma extensão de repetição de nucleotídeo.
  7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o agente de bissulfito é utilizado em uma concentração de 3 M em um pH de 5,0.
    8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é aquecida por 10 a 20 minutos em uma
    Petição 870190071899, de 26/07/2019, pág. 11/13
    3/4 temperatura entre 80°C e 95°C.
  8. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o bissulfito é removido por purificação baseada em coluna,
    purificação baseada em conta ou precipitação. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que após remoção do bissulfito, a amostra tratada é ressuspensa em um tampão de eluição que tem um pH de pelo menos 10. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição tem um pH de 11,5 a 12,5. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição tem pH de pelo menos 12. 13. Método, de acordo com qualquer uma das
    reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que inclui ainda fornecer iniciadores ou sondas de ácido nucleico para a amostra tratada.
  9. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico alvo é detectada por amplificação.
  10. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a amplificação é PCR, qPCR, PCR de transcrição inversa, PCR digital, amplificação
    Petição 870190071899, de 26/07/2019, pág. 12/13
    4/4 isotérmica ou amplificação de sinal.
  11. 16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico alvo é detectado sequenciando a amostra tratada.
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