BR112013015675A2 - circovísrus porcino tipo 2 (pcv2), composição imunogênica que contém o mesmo, kit de teste e aplicação do mesmo - Google Patents

circovísrus porcino tipo 2 (pcv2), composição imunogênica que contém o mesmo, kit de teste e aplicação do mesmo Download PDF

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Abstract

Circovírus Porcino Tipo 2 (Pcv2), Composição Imunogênica Que Contém O Mesmo, Kit De Teste E Aplicação Do Mesmo. A invenção fornece uma cepa de circovírus porcino tipo 2 (PCV2) inovadora que foi depositada no China Center for Type Culture Collection (CCTCC) sob número de acesso V201117. A invenção também fornece composições imunogênicas que contêm a cepa de PCV2 inovadora, kits de teste de PCV2 e aplicações da cepa de PCV2 inovadora.

Description

,/ m 1/22 *' Circovírus porcino tipo 2 (PCV2), composição imunogênica que contém o mesmo, kit de teste e aplicação do mesmo.
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo de cuidados com a 5 saúde animal, particularmente a uma cepa de circovírus porcino tipo 2 (PCV2) inovadora, uma composição imunogênica que contém a cepa de vírus, kit de teste de PCV2 e aplicação da cepa de virus.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO . O circovírus porcino (PCV) foi primeiro encontrado em uma . 10 linhagem celular de rim de porco (PK-15, ATCC CCL33). Embora o circovírus porcino possa continuamente contaminar céiulas PK-15, o vÍrus não provoca o efeito citopático - (CPE) nas células PK-15 contaminadas. Além disso, o PCV derivado de PK-15 é
W considerado apatogênico. Mesmo embora o circovírus porcino possa infectar porcos, o mesmo não causa lesões nos porcos infectados. O circovirus porcino é um vÍrus de DNA 15 de filamento único icosaédrico com um genoma circular de 1.759 pares de base (bp). O PCV derivado de PK-15 foi classificado na família Clrcoviridae em 1995. Em 1991, sÍndrome multissistêmica do definhamento pós-amamentação (PMWS) foi primeiro registrada em porcos no Canadá. A PMWS afeta leitões de 5 a 12 semanas de idade. É clinicamente caracterizada por sintomas como 20 perda de peso progressiva, dispneia, palidez e ictericia ocasional. Suas lesões microscópicas características incluem depleção linfoide com infiltrados histiocíticos no interior de órgãos linfoides, pneumonia, inflamação granulomatosa, hepatite e nefrite. Desde o surto de 1991 no Canadá, a PMWS foi relatada em muitos países em América do Norte, Europa, e Ásia. Mais tarde, um novo circovírus foi isolado a partir de porcos com - 25 PMWS. Visto que a morfologia da circovírus porcino derivado de PMWS é muito similar àquela do PCV derivado de PK-15, os dois circovírus porcinos compartilham somente 68 a 76% de homologia em suas sequências de genoma. O PCV derivado de PK-15 apatogênico e o PCV derivado de PMWS patogênico foram identificados adicionalmente como circovirus porcino tipo 1 (PCVl) e circovírus porcino tipo 2 (PCV2), respectivamente. 30 O circovlrus porcino tipo 2 (PCV2) também pertence à famllia Circoviridae. PCV2 é um virus de DNA circular de filamento único icosaédrico não envelopado com um diâmetro de 17 nm, conhecido como um dos menores vírus animais. O genoma circular de PCV2 contém a origem de replicação com um estrutura em laço de tronco, que é uma característica comum de circovirus. O genoma de PCV2 compreende 35 1.767 ou 1.768 nucleotídeos e pressupostamente tem 11 arcabouços de leitura aberta potenciais (ORFS). Entre os 11 ORFS, ORF 1 e ORF 2 são provavelmente os genes mais importantes que codificam as proteínas de replicação (Rep e Rep') e um proteina de capsídeo (Cap), respectivamente. A proteína de capsideo (Cap) codificada por gene de
ORF2 de PCV2 provavelmente seria o antigeno que induz à produção de anticorpos neutralizadores. A infecção por PCV2 é propagada pela maioria das fazendas de criação de porcos no mundo. Foi constatado que o PCV2 é causador de baixas taxas 5 de sobrevivência e baixas taxas de conversão de alimentação (FCRS) de porcos infectados e o que resulta em grandes perdas econômicas na criação de porcos. Portanto, é importante desenvolver kits de teste de PCV2 e vacina contra PCV2.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
V O primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma . 10 cepa de PCV2 que foi isolada a partir de porcos que mostram sintomas clínicos de sindrome multissistêmica do definhamento pós-amamentação (PMWS), analisada - adicionalmente e confirmada de ser uma cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H). O ' filamento positivo (+) do genoma da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H) tem uma sequência de DNA da SEQ ID No: 1. A cepa de PCV2 inovadora foi depositada no China " 15 Center for Type Culture Coilection (CCTCC) em 5 de novembro de 2011 sob o número de acesso V201117. O segundo aspecto da presente invenção refere-se a uma composição imunogênica que contém a cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H). Em uma modalidade preferencial, a composição imunogênica é uma vacina que compreende 20 um vírus inativado ou um virus atenuado da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H) e um veiculo farmaceuticamente aceitável. No entanto, os tipos da vacina incluem, mas sem limitação a vacina inativada, vacina viva (atenuada) (através da atenuação de vírus), - vacina de subunidade, vacina de DNA e outras vacinas derivadas e produzidas a partir da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H) ou a partir das sequências de aminoácidos ou - 25 DNA da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H). O processo de inativação (ou tratamento inativado) da presente invenção inclui, mas sem limitação a tratamento por reagente de inativação, tratamento por calor e outros tratamentos conhecidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Os reagentes de inativação incluem, mas sem limitação a formaldeído, 30 paraformaldeido, beta-propiolactona (BPL), etilerieimina binária (BEI) ou outros reagentes de inativação adequados para a presente invenção. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitação a solvente, emulsificante, agente de suspensão, decompositor, agente de ligação, excipiente, agente estabilizante, agente quelante, diluente, agente gelificante, 35 conservante, lubrificante, tensoativo, adjuvante ou outros veículos adequados. O adjuvante inclui, mas sem limitação a adjuvante em óIeo (como óIeo mineral, óleo de pIanta, óleo animal, Adjuvante Completo de Freund, Adjuvante lncompleto de Freund, etc.), adjuvante aquoso (como hidróxido de aluminio),
adjuvante de emulsificação bifásica (como adjuvante de emulsão de água em óleo em água, w/O/w), adjuvante biológico (como toxoide e oligodeoxinucleotÍdeo de CpG), etc.
O adjuvante de emuisificação bifásica compreende um tensoativo e uma substância oleaginosa.
O tensoativo é um ou mais de um selecionado a partir do grupo que consiste 5 em éster de ácido graxo de sorbitol; o concentrado de éster de ácido graxo de sorbitol e óxido etileno (ou óxido propileno); éster de ácido graxo de manitol; o concentrado de éster de ácido graxo de manitol e óxido etileno (ou óxido propileno); éster de ácido graxo de manitol modificado com um grupo hidrofílico que é um ou mais de um selecionado a partir . do grupo que consiste em ácido carboxílico, amina, amida, álcool, poliol, éter e óxido;
. 10 éster de ácido graxo de anidromanitol; éster de ácido graxo de anidromanitol modificado com um grupo hidrofílico que é um ou mais de um selecionado a partir do grupo que a consiste em ácido carboxílico, amina, amida, álcool, poIiol, éter e óxido; éster de ácido a graxo de sacarose; o concentrado de éster de ácido graxo de sacarose e óxido etileno (ou óxido propileno); éster de ácido graxo de glicerol; o concentrado de éster de ácido graxo " 15 de glicerol e óxido etileno (ou óxido propileno); o concentrado de ácido graxo e óxido etileno (ou óxido propileno); o concentrado de álcool graxo e óxido etileno (ou óxido propileno); e glicerofosfolipÍdeo.
A substância oleaginosa é uma ou mais de uma selecionada a partir do grupo que consiste em óleo mineral, óleo de planta e óleo animal.
A composição imunogênica da presente invenção 20 compreende adicionalmente pelo menos um antigeno patógeno.
Os antigenos patógenos incluem, mas sem limitação a antígeno de VÍrus da Gripe Suína (SlV), antigeno de vÍrus da sÍndrome respiratória e reprodutiva dos porcinos (PRRSV), antígeno de micoplasma,
- antigeno de parvovírus porcino (PPV), antígeno de erisipela, e antígeno de vÍrus da pseudorraiva (doença de Aujeszky). Os tipos de antigenos patógenos incluem, mas sem
- 25 limitação a proteínas recombinantes, proteínas de subunidade, patógenos com defeito de gene, patógenos antigenos inativados, etc.
O terceiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para proteção de porcos a partir da infecção por PCV2 que inclui a administração de uma dose imunológica efetiva da dita composição imunogênica de PCV2 a um porco 30 para intensificar sua imunidade contra infecção por PCV2, reduzir a severidade de viremia e sintomas cIínicos e aumentar a taxa de sobrevivência e peso corporal.
O quarto aspecto da presente invenção refere-se a um anticorpo anti-PCV2 derivado a partir da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H). O anticorpo inclui, mas sem limitação a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e 35 anticorpos geneticamente modificados.
Em uma modalidade preferencial, o anticorpo é um anticorpo policlonal obtido por meio da injeção de um animal com a cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H). Em outra modalidade preferencial, o anticorpo é um anticorpo monoclonal obtido por meio de triagem de uma biblioteca de hibridoma monoclonal.
O quinto aspecto da presente invenção refere-se a fragmentos de DNA da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H). Os fragmentos de DNA têm sequências de nucleotÍdeos da SEQ ID No: 1, 2, 4, e 6. As aplicações dos 5 fragmentos de DNA incluem, mas sem limitação à produção de vacina de DNA e vacina de subunidade e a projeção de iniciadores ou sondas para detectar o vírus PCV2 em uma amostra.
Em uma modalidade preferencial, o fragmento de DNA é a sequência de genoma de comprimento total (SEQ ID No: 1) da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 " H). Em outra modalidade preferencial, os fragmentos de DNA são os arcabouços de
. 10 leitura aberta (ORFs) da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H) que incluem, mas sem limitação ao: arcabouço de leitura aberta 1 (ORFI) que tem uma . & sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 2 que codifica uma sequência de aminoácidos daSEQIDNo:3, " 15 arcabouço de leitura aberta 2 (ORF2) que tem uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 4 que codifica uma sequência de aminoácidos daSEQIDNo:5,e arcabouço de leitura aberta 3 (ORF3) que tem uma sequência de nucleotÍdeos da SEQ ID No: 6 que codifica uma sequência de aminoácidos 20 daSEQIDNo:7. O sexto aspecto da presente invenção refere-se a um kit de teste para PCV2. O kit de teste é usado para detectar vÍrus PCV2 ou anticorpos anti-PCV2 em uma amostra de teste.
O kit de teste inclui, mas sem limitação a: (1) um antígeno da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H), em uma modalidade preferencial, o antígeno " 25 é depositado em uma placa de antígeno e inativado com um reagente de inativação; (2) um anticorpo poIiclonal ou monoclonal derivado a partir da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H); (3) um anticorpo ou antígeno geneticamente modificado derivado a partir da sequência de genoma de comprimento total (SEQ ID No: 1) ou os fragmentos de nucleotídeo (SEQ ID No: 2, 4, e 6) da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H); e (4) 30 um polinucleotídeo derivado a partir da sequência de genoma de comprimento total (SEQ ID No: 1) ou os fragmentos de nucleotÍdeo (SEQ ID No: 2, 4, e 6) da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H). O poIinucleotÍdeo inclui, mas sem limitação a iniciadores e sondas.
Em uma modalidade preferencial, o pdinucleotídeo é um iniciador que pode ser usado para detectar a cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H), e os iniciadores têm as 35 sequênciaS de nucleotideos da SEQ ID No: 8 a 11. Os tipos de o kit de teste incluem, mas sem limitação a kit de ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA), kit de microarranjo, kit de ensaio imunofluorescente (IFA), kit de reação de cadeia de polimerase e outros kits de teste derivados a partir da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H). Em uma modalidade preferencial, o kit de teste compreende pelo menos uma placa de antígeno que compreende cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H) e o kit de teste pode ser usado para detectar anticorpos anti-PCV2 em uma amostra de teste. 5 A cepa de PCV2 inovadora (cepa'de PCV2 H) da presente invenção inclui todas as passagens subcultivadas e os mutantes que têm as características de vÍrus genoma ou patogenicidade similares às da cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H).
V Os termos "DNA (ácido nucleico)", "polinucleotÍdeo", . 10 "aminoácido", "peptideo", "polipeptídeo" na presente invenção pode existir nos estados natural, isolado, recombinante ou sintético. W Os termos "impedir", "proteger" e "ser contra" referem-se à m observação que comparados com os animais que não são vacinados com a composição imunogênica revelada, os animais vacinados com a composição imunogênica revelada 15 podem ter uma habilidade intensificada contra a infecção por PCV2 e contra as doenças relacionadas resultadas a partir de infecção por PCV2. O significado dos termos técnicos e científicos conforme descrito no presente documento pode ser claramente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica. 20 A presente invenção é descrita em mais detalhes nos seguintes exemplos iiustrativos. Embora os exemplos possam representar somente modalidades selecionadas da invenção, deveria ser entendido que os seguintes exemplos - são ilustrativos e não Iimitantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS · 25 - Figura IA: Células PK-15 não infectadas, cultivadas por 4 dias (magnitude (100")); Figura IB: células PK-15 infectadas com cepa de PCV2 H, cultivadas por 4 dias (magnitude (100")). - Figura 2: Análise filogenética de sequência de genoma de cepa de PCV2 H. Figura 3: Alinhamento de sequência de aminoácidos de 30 ORF2 (SEQ ID No: 5) de cepa de PCV2 H e três outras sequências de aminoácidos que têm as similaridades de sequência mais altas com a sequência de aminoácidos de ORF2 de cepa de PCV2 H no banco de dados do Gen8ank do Centro Nacional de lnformação Biotecnológica (NCBI). - Figura 4: Alinhamento de sequência de aminoácidos de ORF2 de cepa de PCV2 H e 35 sequência de aminoácidos de ORF2 (número de acesso do Gen8ank: ADD25772) de um protótipo de PCV2 2d (número de acesso do Gen8ank: ZJ0955b). - Figura 5: Resultados de ELISA de PCV2 de amostras de soro coletadas em diferentes pontos de tempo a partir de camundongos vacinados com vacina inativada de cepa de
PCV2 H. - Figura 6: Resultados de PCV2 IFA de amostras de soro coletadas em diferentes pontos de tempo a partir de leitões vacinados com vacina inativada de cepa de PCV2 H. - Figura 7: Pesos corporais de leitões vacinados com vacina inativada de cepa de PCV2 5 H.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERENCIAL Exemplo 1 lsolamento e ldentificação de VÍrus PCV2
1. Origem e lsolamento de VÍrus Semente:
F As amostras de tecido foram coletadas a partir de nodo de . 10 linfa e pulmão de leitões em um fazenda de criação de porcos em Hsin-Chu, Taiwan. Esses leitões tinham 8 semanas de idade e apresentaram sintomas clínicos de sindrome . multissistêmica do definhamento pós-amamentação (PWMS). As amostras de nodo de ' linfa e pulmão foram coletadas e congeladas a -70 °C. A fim de isolar vÍrus, as amostras de tecido foram " 15 homogeneizadas e 0,2 ml de cada homogeneizado foi inoculado em células PK-15 de monocamada ou suas linhagens celulares derivadas que são livres de circovírus porcino (PCV), vÍrus de febre suína clássica (CSFV), adenovírus porcino, paNovÍrus porcino, vÍrus da sÍndrome respiratória e reprodutiva dos porcinos (PRRSV), vÍrus da pseudorraiva (PRV), vírus de doença vesicular suína (SVDV), micoplasma e bactérias. Após incubadas 20 por 1 hora a 37 °C, 5°/0 de CO2, as células foram lavadas três vezes com solução salina estérii tamponada de fosfato (PBS). Em seguida, as células foram incubadas com meio de MEM que contém 2% de FBS por 4 horas a 37 °C, 5°/0 de CO,. Em seguida, o meio de - MEM foi descartado e as células foram incubadas com 300 mM de D-glucosamina por 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS estéril e incubadas - 25 com meio de MEM que contém 8°/0 de FBS por 72 horas a 37 °C, 5°6 de CO2. Finalmente, as culturas de célula foram testadas para PCV2 com ensaio de imunofluorescência (IFA). O protocolo de IFA é descrito como segue. Primeiro, as células de amostra foram lavadas três vezes com PBS estéril, 5 minutos cada vez e fixadas com 75 µ1 de 80% de acetona por 30 minutos a 4 °C. Em seguida, a acetona foi 30 descartada e as células foram lavadas três vezes com PBS estéril, 5 minutos cada vez. Em seguida, as células foram incubadas com 75 µ1 de antissoro policlonal antiviral de circovírus porcino (VMRD®) (anticorpo primário, 1:1.500 de diluição em PBS) por 30 minutos a 37 °C. Em seguida, o antissoro foi descartado e as células foram lavadas três vezes com PBS estéril, 5 minutos cada vez. Em seguida, as células foram incubadas com 35 75 µ1 de lgG-FITC antiporco de coelho (molécula integral) (Sigama, F1638) (anticorpo secundário, 1:1.000 de diluição em PBS) por 30 minutos a 37 °C. Em seguida, o .anticorpo foi descartado e as células foram lavadas três vezes com PBS estéril, 5 minutos cada vez. Finalmente, cada uma das amostras de célula em um prato de cultura de 96 cavidades foi montada em 200 µ1 de PBS para exame microscópico fluorescente. O vÍrus que infectou as células e rendeu o resultado mais positivo de IFA foi selecionado como o vÍrus semente. A sequência de genoma do vÍrus semente foi em seguida determinada, como apresentado na SEQ ID No: 1. A sequência 5 foi alinhada, analisada e finalmente confirmada de ser um nova cepa de PCV2 (análises e resultados de alinhamento de sequência são descritos abaixo). Essa cepa de PCV2 inovadora é nomeada cepa de PCV2 H.
2. Subcultura de VÍrus Semente:
P As células PK-15 recentemente preparadas ou suas . 10 linhagens celulares derivadas foram inoculadas com a cepa de PCV2 inovadora (cepa de PCV2 H) e o vÍrus colhido a partir das células inoculadas foi a passagem 1 (Pi) de cepa de . PCV2 H. O sobrenadante da cultura de célula que contém P, de cepa de PCV2 H foi ' coletado, diluldo (1:2) e inoculadas nas células PK-15 recentemente preparadas ou suas linhagens celulares derivadas. Após as células inoculadas terem sido incubadas por 3 dias, 15 o sobrenadante da cultura de céluia que contém a passagem 2 (P2) de cepa de PCV2 H foi coletado, diluído (1:2) e inoculado nas células PK-15 recentemente preparadas ou suas linhagens celulares derivadas. As células inoculadas foram incubadas por 3 dias; e o sobrenadante de cultura de célula que contém a passagem 3 (P3) de cepa de PCV2 H foi em seguida coletado. O processo foi repetido três vezes mais para obter a passagem 6 20 (P6) de cepa de PCV2 H. Durante o processo de cultura de células PK-15 ou suas linhagens celulares derivadas que foram inoculadas com cepa de PCV2 H, o efeito - citopático (CPE) foi observado nas células inoculadas, conforme mostrado na Figura 1B. Além disso, a Figura 1A mostra a morfologia e crescimento de células PK-15 não " 25 inoculadas após 4 dias de cultura de (lOOx), visto que a Figura 1B mostra a morfologia e k crescimento de células PK-15 inoculadas com cepa de PCV2 H após 4 dias de cultura de (lOOx). De modo similar, o CPE observado em linhagens celulares derivadas de PK-15 que são inoculadas com cepa de PCV2 H pode ser consultado na Figura 1B a título de referência. 30 3. ldentificação de VÍrus Semente: O genoma de cepa de PCV2 H isolado na presente invenção tem uma" sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 1. A sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 1 foi comparada com sequências no banco de dados do Gen8ank do Centro Nacional de lnformação Biotecnológica (NCBI). Os resultados da comparação mostram 35 que a cepa de PCV2 H foi 99°6 homóloga a algumas sequências de PCV2 (Tabela 1), mas não há sequência alguma no banco de dados idêntica (100% homóloga) à sequência de genoma da cepa de PCV2 H (SEQ ID No: 1). Assim, com base nos resultados de alinhamento, o vÍrus isolado na presente invenção, cepa de PCV2 H, mostra pertencer à família de PCV2 e de uma nova cepa. Com base na análise filogenética da sequência de genoma da cepa de PCV2 H mostrada na Figura 2, a cepa de PCV2 H mostra ser um membro do subgrupo de PCV2 2d. Tabela 1 Resultados de comparação de cepa de PCV2 H 5 DNA genômico e sequências no banco de dados do GenBank do NCBI com uso do
NCBI BLAST Pontuação Pontuação Máx N° de acesso Descrição Máx Total ident. HM038017.1 Cepa de Circovlrus porcino 2 BDH 3.236 3.236 99% GUO01710.1 lsolado de Circovírus porcino 2 3.236 3.236 99% BJ0901b a Cepa de Circovírus porcino 2 3.236 3.236 99°/ EF675230.1 GXHZ-l '° ® GU083583.1 lsolado de PCV2C53 Circovirus porcino 2 3.230 3.230 99% & GQ359002.1 Cepa de Circovírus porcino 2 3.230 3.230 99°/o GX0839 - lsolado de Circovírus porcino 2 3.230 3.230 99°/ FJ644929.1 GL08 '° FJ426398,1 Cepa de Circovírus GXWZ-l porcino 2 3.230 3.230 99% HM038030.1 Cepa de Circovírus porcino 2 AH 3.229 3.229 99% lsolado de Circovlrus porcino 2 3.225 3.225 99°/ HM161710.1 BX-2 '° Uma análise mostra que a cepa de PCV2 H da presente invenção tem arcabouços de leitura aberta (ORFs) 1, 2, e 3. O ORFI tem uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 2 que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: - 10 3. O ORF2 tem uma sequência de nucleotideos da SEQ ID No: 4 que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 5. O ORF3 tem uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 6 que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 7. Devido ao fato de que a proteina de capsídeo codificada pelo gene de ORF2 de PCV2 provavelmente seria o antígeno que induz a produção de 15 anticorpos neutralizadores, a sequência de nucleotídeos (SEQ ID No: 4) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID No: 5) do ORF2 de cepa de PCV2 H foram comparadas com as sequências no banco de dados do Gen8ank de NCBI. Os resultados da comparação mostram que nenhuma sequência no banco de dados do Gen8ank de NCBI é idêntica (100% homóloga) à sequência de nucleotídeos (SEQ ID No: 4) ou à sequência de 20 aminoácidos (SEQ ID No: 5) de ORF2 de cepa de PCV2 H. A homologia mais alta entre a sequência de aminoácidos do ORF2 de cepa de PCV2 H (SEQ ID No: 5) e as sequências no banco de dados do Gen8ank é 98°/o. A Figura 3 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de ORF2 de cepa de PCV2 H (SEQ ID No: 5) e das três primeiras sequências de homologia mais alta e o alinhamento indica que há 6 aminoácidos da SEQ 25 ID No: 5 diferentes provenientes das três primeiras sequências. A sequência de aminoácidos (SEQ ID No: 5) de ORF2 de cepa de PCV2 H foi comparada adicionalmente com a sequência de aminoácidos (Número de Acesso do Gen8ank: ADD25772) de ORF2 de um subgrupo de protótipo de PCV2 2d (Número de Acesso do Gen8ank: ZJ0955b) e o resultado mostrado na Figura 4 indica que há 7 aminoácidos diferentes entre as duas 5 sequências e as duas sequências compartilham 97% de homologia. Além disso, as sequências de nucleotídeos (SEQ ID No: 2 e 6) e as sequências de aminoácidos (SEQ ID No: 3 e 7) do ORFI e ORF3 de cepa de PCV2 H foram comparadas com sequências no banco de dados do Gen8ank de NCBI. O . resultados da comparação mostram que nenhuma sequência no banco de dados do . 10 Gen8ank de NCBI é idêntica (100% homóloga) às sequências de nucleotídeos ou às sequências de aminoácidos de ORFI ou ORF3 de cepa de PCV2 H.
, As análises indicam que a cepa de PCV2 H da presente 6 invenção é um cepa de circovírus porcino tipo 2 (PCV2) inovadora. A cepa de PCV2 inovadora foi depositada no China Center for Type Culture Collection (CCTCC) em 5 de " 15 novembro de 2011 sob o número de acesso V201117. Exemplo 2 Preparação de Vacina contra cepa de PCV2 H
1. Cultura de VÍrus As células PK-15 livres de circovírus porcino (PCV), vÍrus de febre suína clássica (CSFV), adenovírus porcino, parvovírus porcino, vÍrus da sÍndrome 20 respiratória e reprodutiva dos porcinos (PRRSV), vÍrus da pseudorraiva (PRV), vÍrus de doença vesicular suína (SVDV), micoplasma e bactérias foram cultivadas em meio de crescimento de cultura de célula (meio de MEM que contém 5°/0 de FBS, pH 7,2±0,2) a 37 °C, 5°/0 de CO,. Após uma monocamada de células PK-15 ter sido formada, as células PK-15 foram dissociadas com 0,2% de tripsina-EDTA e suspensa em meio de - 25 manutenção de cultura de célula (meio de MEM que contém 2°/0 de FBS, pH 7.4±0,2) para contagem de células. Em seguida, as células foram diluidas com meio de crescimento de cultura de célula a uma concentração final de 3,0x10' células/ml e alocadas em garrafas giratórias para cultura por 3 a 4 dias a 37 °C para alcançar uma monocamada confluente. Em seguida, o meio de cultura de célula no interior das garrafas giratórias foi descartado e 30 as células foram lavadas com PBS. A estirpe viral de cepa de PCV2 H foi diluído com meio de manutenção de cultura de célula a uma concentração final de 1q'-o TC|D50/m| e inoculado nas monocamadas de células PK-15 nàs garrafas giratórias. Para cultura de vÍrus, as células infectadas foram incubadas por 48 a 96 horas a 37 °C. O título de vÍrus de cepa de PCV2 H foi monitorado por ensaio de imunofluorescência (IFA). Em seguida, a 35 fim de coIetar a soIução de vÍrus de cepa de PCV2 H, o sobrenadante das culturas de célula foi coIhido quando o título de vÍrus atingiu 10'0 TC|D50/m| ou mais alto ou quando o efeito citopático (CPE) atingiu 70 a 80%.
2. Processo inativado
Trinta e sete por cento (37%, em peso) de formaldeído foi adicionado à solução de vÍrus de cepa de PCV2 H coletada na etapa mencionada acima a uma concentração final de 0,2% (p/v) e em seguida o vÍrus foi inativado por agitação contínua com formaldeído por pelo menos 24 horas, preferencialmente 48 horas, a 37 °C.
5 Após o vÍrus ter sido completamente inativado, a solução de vÍrus de cepa de PCV2 H que contém formaldeído foi centrifugada para remover o formaldeído. Em seguida, a solução de vÍrus centrifugada foi suspensa em solução de tampão, como água destilada ou solução salina tamponada de fosfato (PBS), e a solução de vÍrus suspensa foi a estirpe de ' antigeno inativado de vacina inativada de cepa de PCV2 H e armazenada a 4 °C para uso . 10 posterior.
3. Preparação de vacina inativada contra PCV2 H Um adjuvante de emulsificação bifásica esterilizada, como q adjuvante de vacina oleosa MONTANIDE'" ISA 206 para emulsão de água em óleo em água (VV/ONV), foi adicionado à estirpe de antígeno inativado de vacina inativada de cepa 15 de PCV2 H a uma concentração final de 50% (v/v) em um tanque de emulsão para mistura e emulsificação. O produto emulsificado é a vacina inativada de cepa de PCV2 H com adjuvante de óleo. Outros adjuvantes adequados para a vacina inativada contra PCV2 da presente invenção conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica podem 20 também ser usados como o adjuvante na presente invenção. O adjuvante de emulsificação bifásica (como adjuvante de emulsão de água em óleo em água) usado nesse exemplo pode ser substituldo por, mas sem limitação a adjuvante em óleo (como . óleo mineral, óleo de planta, óleo animal, Adjuvante Completo de Freund, Adjuvante Incompleto de Freund, etc.), ad juvante aquoso (como hidróxido de alumínio) ou adjuvante - 25 biológico (como toxoide e oligodeoxinucleotídeo de CpG). Exemplo 3 Preparação de Kit de teste de PCV2 - 1 O kit de teste de PCV2 nesse exemplo é uma placa de antígeno que contém o antígeno viral de cepa de PCV2 H. Primeiro, as células PK-15 ou suas linhagens celulares monoclonais foram cultivadas, tripsinizada e ressuspensas em 30 meio de cultura de célula a uma concentração final de 2MO' célulashnl. Cinquenta microlitros (µ1) das células PK-15 e 50 µ1 de estirpe viral de cepa de PCV2 H (1x1O' TC|D50/m|) foram adicionados a cada cavidade de um pIaca de cultura de célula de 96 cavidades (fundo plano) e incubadas por 72 horas a 37 °C, 5°/0 de CO2. As células infectadas com cepa de PCV2 H foram lavadas duas vezes com PBS esterilizado e 35 fixadas com 80% de acetona por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida a acetona foi descartada e as células foram Iavadas três vezes com PBS esterilizado. Em seguida, a placa foi invertida e em seguida secada em uma incubadora de 37 °C. A placa secada é a placa de antígeno que contém o antigeno viral de cepa de PCV2 H e pode ser usado para teste de ELISA para detectar a quantidade de anticorpos contra PCV2 em uma amostra de soro. A placa em seguida foi armazenada a -20 °C para uso posterior. (Tischer et al., 1995) Exemplo 4 Preparação de Kit de teste de PCV2 - 2 5 O kit de teste de PCV2 nesse exemplo é uma placa de antígeno que contém uma proteína de capsídeo recombinante de cepa de PCV2 H. A proteína de capsideo recombinante é o antígeno da placa de antígeno. A proteína de capsídeo é codificada pelo gene de ORF2 de cepa de PCV2 H e tem a sequência de
P aminoácidos da SEQ ID No: 5.
. 10 A sequência de nucleotídeos de ORF2 de cepa de PCV2 H foi primeiro ampliada por reação de cadeia de polimerase (PCR). O DNA viral da cepa de . PCV2 H foi usado como o DNA padrão na reação de PCR. Um iniciador direto e um " iniciador inverso foram projetados para ampliar a sequência de nucleotldeos de ORF2. O " iniciador direto nesse exemplo tem um sÍtio de clivagem Hlnd |||, e o iniciador inverso 15 nesse exemplo tem um sitio de clivagem Xho I. Os iniciadores podem ser projetados de acordo com a sequência de nucleotídeos de ORF2 (SEQ ID No: 4) da presente invenção por aquelas pessoas versadas na técnica. Para a reação de PCR, uma mistura de PCR que contém 8 µ1 de DNA padrão, 5 µ1 de tampão lOx de PCR (MDB1O, lnc.), 8 µ1 de dNTPs (cada a 1,25 mM), 1 µ1 de cada iniciador (cada a 50 µM) e 0,5 µ1 de DNA poIimerase de 20 Pfu (MDB1O, lnc.) em um volume final de 50 µ1 foi colocado em um reator GeneAmp PCR System 240'0 (Applied Biosystems). A reação de PCR iniciou com uma etapa inicial de pré-aquecimento da mistura de PCR a 95 °C por 5 minutos e a ampliação de DNA foi · conduzida por 25 ciclos com os seguintes parâmetros; desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 30 segundos.
- 25 A reação de PCR foi completada com uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C. Os produtos de PCR foram purificados com Kit de Limpeza de PCR-M (Viogene). Após a purificação, os produtos de PCR foram construídos em um vetor de expressão pET24a. Os produtos de PCR purificados e o vetor de expressão pET24a (Novagen) foram digeridos com duas enzimas de restrição (New 30 England Biolabs), Hind lll e Xho I, respectivamente por 8 horas a 37 °C. Após a reação de cIivagem de enzima de restrição, os produtos de PCR digeridos e o vetor de expressão pET24a foram purificados com Kit de Limpeza de PCR-M (Viogene) respectivamente. Os produtos de PCR purificados foram ligados com o vetor de expressão pET24a purificados e o produto de ligação foi transformado nas células hospedeiras (E. coh). Os 35 transformantes foram selecionados e um cIone com a sequência correta foi identificado por sequenciamento de DNA e nomeado pET24a-ORF2. As bactérias com pET24a-ORF2 foram cultivadas em 2 ml de caldo de LB por 16 a 18 horas a 37 °C e em seguida a cultura foi adicionada ao caldo de
LB fresco que contém 25 µg/ml de canamicina a uma razão de 1:50 e cultivada a 37 °C, 200 rpm. Quando a densidade óptica a um comprimento de onda de 600 nm (OD600) da cultura atingiu 0,6, isopropi|-í3-D-tioga|actosÍdeo (IPTG) foi adicionado à cultura a uma concentração final de 1 mM e a cultura foi incubada por mais 6 horas a 37 °C, 200 rpm. 5 Um mililitro da cultura foi centrifugado (10.000 xg) e em seguida determinado se as proteínas recombinantes eram proteínas solúveis ou corpo de inclusão com Extração de Proteína Bacteriana B-PERTM (Pierce Protein Research Produces). Quarenta microlitros
Z (µ1) de reagente foram adicionados às bactérias centrifugadas e agitados em um . misturador de vórtice por 1 minuto. A mistura foi em seguida centrifugada a 10.000 xg. As . 10 proteinas suspensas no sobrenadante eram proteínas solúveis, ao passo que as proteínas na parte inferior (pélete) eram corpos de inclusão. As proteínas solúveis foram . dissolvidas em lx tampão de amostra para análise de SDS-PAGE, ao passo que os n corpos de inclusão foram misturados com 2x tampão de amostra para análise de SDS-PAGE. Ambas as amostras foram fervidas por 20 minutos e em seguida centrifugada. 15 As proteinas no sobrenadante de ambas as amostras foram solucionadas com 15% de SDS-PAGE para analisar a expressão da proteína de capsideo recombinante de cepa de PCV2 H. Após as análises, a proteína de capsídeo recombinante de cepa de PCV2 H foi usada para gerar as placas de antígeno. A proteina de capsídeo recombinante de cepa de PCV2 H foi 20 diluída com PBS (pH 9,6) a uma concentração final de 10 µg/ml. A proteína recombinante diluída foi revestida em uma placa de cultura de célula de 96 cavidades (fundo plano) (100 µl/cavidade) a 37 °C por2 horas e em seguida a 4 °C de um dia para o outro. Em seguida, cada cavidade da placa foi lavada três vezes com PBS por 3 a 5 minutos e adicionados 200 µ1 de solução bloqueadora de BSA a 15°/o para bloquear a proteína recombinante por " 25 2 horas a 37 °C. Após cada cavidade da placa ter sido lavada com PBS, a placa foi armazenada a 4 °C para uso posterior. Exemplo 5 Preparação de Anticorpos anticepa de PCV2
H
1. Anticorpos policlonais anticepa de PCV2 H 30 A cepa de PCV2 H inativado com titulo de vÍrus suficiente foi misturada com um adjuvante adequado, como Adjuvante Completo de Freund. A mistura foi primeiramente inoculada em animais, como camundongos, porcos, cabras e coelhos e uma segunda imunização pode ser realizada após um periodo de tempo apropriado (como 2 a 3 semanas) se necessário. Após outro período de tempo apropriado (como 2 a 3 35 semanas), o soro dos animais inoculados foi coletado como anticorpos policlonais anticepa de PCV2 H. Os anticorpos policlonais anticepa de PCV2 H podem ser conjugados a repórteres cromogên icos ou fluorescência se necessário.
Os animais inoculados podem ser vacinados adicionalmente para reforçar o tltulo de anticorpo após a imunização primária ou secundária se necessário. Os animais que podem ser inoculadas para produzir 5 anticorpos policlonais anticepa de PCV2 H incluem, mas sem limitação a camundongos, coelhos, aves (Ovos), porcos, cabras, gado bovino e animais aquáticos.
2. Anticorpos monoclonais anticepa de PCV2 H A cepa de PCV2 H inativado com um titulo de vÍrus suficiente " ou um fragmento de antígeno específico (como ORF2) de cepa de PCV2 H foi . 10 primeiramente inoculada em um animal (como um camundongo). O vÍrus inativado ou fragmento de antígeno podem ser misturados com um adjuvante adequado, como Adjuvante Completo de Freund, se necessário. Também, uma segunda imunização pode . ' ser realizada após um período de tempo apropriado (como 2 a 3 semanas) se necessário. Após outro período de tempo apropriado (como 2 a 3 semanas), o soro do animal 15 inoculado foi coletado para avaliar se as células de baço do animal foram adequadas para produção de anticorpos monoclonais anticepa de PCV2 H. A fusão de célula das células de baço adequadas coIetadas a partir do animal inoculado e células de mieloma (como linhagem celular de FO e linhagem celular de NS) foi conseguida com uso de polietileno glicol (PEG, como PEG1500). Os hibridomas que produzem anticorpos de especificidade 20 apropriada foram selecionados a partir de células fundidas e em seguida subclonados para ser hibridomas que são adequados para produzir anticorpos monoclonais anticepa de PCV2 H. Os anticorpos monoclonais anticepa de PCV2 H podem ser - usados em kits de teste, terapia ou alimento ou suplemento alimentar para intensificar a - 25 imunidade dos animais. Exemplo 6 Prova de eficácia de Vacina contra PCV2 inativado -1
1. Protocolo de vacinação e Coleta de amostra Camundongos Balb c livres de patógeno específico (SPF) de 30 cinco a seis semanas de idade foram aleatoriamente divididos em 4 grupos de 15 camundongos cada. O teste de ELISA mostrou que todos os 60 camundongos foram negativos para anticorpos anti-PCV2. Os camundongos nos 3 grupos de vacina (Grupos 1 a 3) foram injetados intramuscularmente com 0,2 ml de 3 lotes diferentes de vacina contra cepa de PCV2 H inativado, respectivamente. Duas semanas após a imunização primária 35 (p.i.), os camundongos nos 3 grupos de vacina foram reforçados com a mesma dose dos 3 lotes diferentes de vacina. Os camundongos no Grupo 4 não foram vacinados e serviram como controle negativo. Em 2, 3, 4 e 5 semanas após a imunização primária (p.i.), 5 camundongos de cada grupo foram aleatoriamente selecionados para 'coletar as amostras de soro. Todas as amostras de soro foram testadas por ELISA.
2. Detecção de anticorpos anti-PCV2 por ELISA As placas de antígeno preparadas no Exemplo 3 ou 4 podem ser usadas como as pIacas de ELISA nesse exemplo. As placas de ELISA foram lavadas 5 3 vezes com 50 mmoles/l de PBS (pH 7,2) que contêm 500 µ1/1 de Tween-20 (isto é PBST) por 3 a 5 minutos cada vez. Para bloquear as placas de ELISA, 200 µ1 de solução bloqueadora de BSA a 15% foram adicionados a cada cavidade das placas de ELISA, e em seguida, as placas de ELISA foram incubadas por 2 horas a 37 °C. Em seguida, as
P placas de ELISA foram iavadas com PBS. As amostras de soro de camundongo foram . 10 diluídas em cinquenta partes (1:50) com PBS e, em seguida, diluídas em duas partes em série. As amostras de soro diluidas foram adicionadas às cavidades das placas de ELISA (100 µl/cavidade) e as placas foram incubadas por 1 hora a 37 °C. Após a incubação, as . ' pIacas foram lavadas com PBS. O anticorpo secundário (como anticorpo secundário de coelho anticamundongo) conjugados à peroxidase de raiz-forte (HRP) foi em seguida " 15 adicionado às cavidades. Após a incubação por 1 hora a 37 °C, as placas foram lavadas com PBS. Para visualização de resultados, 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada às cavidades. Em seguida à incubação, a reação foi interrompida pela adição de 2mM H2SO4. Os resultados foram relatados como razões positivas para negativas (P/N). A razão P/N foi calculada pela divisão de densidade óptica a 450 nm (OD450) de 20 uma dada amostra de teste para a OD450 das razões P/N de controle negativo padrão z 2,1 foram consideradas positivas. As diluições máximas de razões P/N z 2,1 foram consideradas os títulos de anticorpo de ELISA das amostras de soro. Além de HRP e TMB, outros repórteres cromogênicos ou . fluorescência com a mesma função, como fosfatase alcalina (AP), 4-metilumbeliferil - 25 fosfato (4-MUP), e isotiocianato de fluoresceína (FITC), podem também ser usados nesse exemplo.
3. Resultados Em 2 semanas após a imunização primária (p.i.), os anticorpos anticepa de PCV2 H foram detectados em todos os camundongos vacinados. 30 Após a segunda imunização, os títulos de anticorpo de ELISA de camundongos vacinados atingiu 1.800 a 2.000 no 35° dia após a imunização primária (d.p.i.) (Figura 5). Portanto, os resultados indicaram que a vacina contra cepa de PCV2 H inativado da presente invenção teve a capacidade de efetivamente induzir imunorrespostas em camundongos. Exemplo 7 Prova de eficácia de Vacina contra PCV2 35 inativado -2
1. Protocolo de vacinação e Coleta de amostra Dois Ieitões saudáveis de 5 a 6 semanas de idade foram injetados intramuscularmente com 1 ml de vacina contra cepa de PCV2 H inativado,
respectivamente. Três semanas após a imunização primária (p.i.), os leitões foram reforçados com a mesma dose da vacina. As amostras de soro foram coletadas a partir de ambos os leitões antes da imunização primária (5 a 6 semanas de idade), antes da segunda imunização (8 a 9 semanas de idade) e em 2 semanas após a segunda 5 imunização (10 a 11 semanas de idade). Ambos os leitões foram pesados nos mesmos pontos de tempo que a coleta de soro. Todas as amostras de soro foram testadas por ELISA.
2. Detecção de anticorpos anti-PCV2 por ELISA " As placas de antígeno preparadas no Exemplo 3 ou 4 podem . 10 ser usadas como as placas de ELISA nesse exemplo. As placas de ELISA foram lavadas 3 vezes com 50 mmoles/l de PBS (pH 7,2) que contêm 500 µl/l de Tween-20 (isto é PBST) por 3 a 5 minutos cada vez. Para bloquear as placas de ELISA, 200 µ1 de solução . bloqueadora de BSA a 15°6 foram adicionados a cada cavidade das placas de ELISA e em seguida as placas de ELISA foram incubadas por 2 horas a 37 °C. Em seguida, as " 15 placas de ELISA foram lavadas com PBS. As amostras de soro de porco foram diluidas em cinquenta partes (1:50) com PBS e em seguida diluidas em duas partes em série. As amostras de soro diluídas foram adicionadas às cavidades das placas de ELISA (100 µl/cavidade) e as placas foram incubadas por 1 hora a 37 °C. Após a incubação, as pIacas foram lavadas com PBS. O anticorpo secundário (como anticorpo secundário de cabra 20 antiporco) conjugado à peroxidase de raiz-forte (HRP) foi em seguida adicionado às cavidades. Após a incubação por 1 hora a 37 °C, as placas foram lavadas com PBS. Para visualização de resultados, 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada às cavidades. Em seguida à incubação, a reação foi interrompida pela adição de 2mM H,SO4. Os resultados foram relatados como razões positivas para negativas (P/N). A razão P/N - 25 foi calculada pela divisão de densidade óptica a 450 nm (OD450) de uma dada amostra de teste pela OD450 das razões P/N de controle negativo padrão z 2,1 foram consideradas positivas. As diluições máximas de razões P/N z 2,1 foram consideradas os títulos de anticorpo de ELISA das amostras de soro.
3. Resultados 30 Em 3 semanas após a imunização primária (p.i.), os anticorpos anticepa de PCV2 H foram detectados em ambos os leitões vacinados. Em 2 semanas após a segunda imunização, os títulos de anticorpo de ELISA de leitões vacinados foram mais altos que 11.000 (Tabela 2). Portanto, os resultados indicaram que a vacina contra cepa de PCV2 H inativado da presente invenção teve a capacidade de 35 efetivamente induzir imunorrespostas em porcos. Tabela 2 Títulos de anticorpo de ELISA de Ieitões vacinados Pontos de Antes da imunização Antes da segunda Em 2 semanas após a tempo de primária imunização segunda imunização
Amostragem (5 a 6 semanas de (8 a 9 semanas de (1Oa11 semanasde idade) idade) idade) Leitão 1 1 8.490 11.728 Leitão 2 1 10.263 13.065 Exemplo 8 Prova de eficácia de Vacina contra PCV2 inativado -3
1. Protocolo de vacinação e CoIeta de amostra Quarenta leitões saudáveis de 2 semanas de idade foram 5 aleatoriamente divididos em 4 grupos de 10 leitões cada. Com idade de 3 semanas, os " leitões nos 3 grupos de vacina (Grupos 1 a 3) foram injetados intramuscularmente com 1 a ml de 3 lotes diferentes de vacina contra cepa de PCV2 H inativado, respectivamente. Três semanas após a imunização primária (p.i.), os leitões foram reforçados com a
P mesma dose da vacina. Leitões no Grupo 4 não foram vacinados e serviram como · 10 controle negativo. As amostras de soro foram coletadas a partir de todos os leitões 1 semana antes da imunização primária (2 semanas de idade) e 1, 2, 3, e 5 semanas após a imunização primária (4, 5, 6 e 8 semanas de idade, respectivamente). Todos os leitões foram pesados com idades de 3, 4, 5, 6 e 8 semanas. Todas as amostras de soro foram testadas por ELISA. 15 Tabela 3 Programa de vacinação e coleta de amostra ldades 2 3 4 5 6 8 (semanas) Vacinação Segunda Vacinação " primária " " vacinação Amostragem Amostragem Amostragem Amostragem Amostragem . Teste 1 de sangue, - de sangue, de sangue, de sangue¶ de sangue, IFA ifa ifa ifa ifa Teste 2 - Pesagem Pesagem Pesagem Pesagem Pesagem .
2. Detecção de anticorpos anti-PCV2 por IFA As placas de antígeno preparadas no Exemplo 3 foram usadas nesse exemplo. As placas de antígeno foram retiradas a partir de -20 °C para descongelar e secar a 37 "C. As amostras de soro de porco foram diluidas em cinquenta 20 partes (1:50) com PBS e, em seguida, diluídas em duas partes em série. As amostras de soro diluídas foram adicionadas às cavidades das placas de antigeno (50 µl/cavidade) e as pIacas foram incubadas por 30 minutos a 37 °C. Após a incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS para remover anticorpos não combinados. Cinquenta microlitros (50 µ1) de lgG de coelho antiporco conjugados a FITC (1:100, Sigma) foram em 25 seguida adicionados às cavidades. Após incubadas no escuro por 30 minutos, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS e examinada sob um microscópio de fluorescência para calcular o título de anticorpos anticepa de PCV2 H. (Rodriguez-Arrioja et al., 2000)
3. Resultados
3.1 Titulo de anticorpo Em 2 semanas após a imunização primária (p.i.), as amostras de soro a partir de leitões vacinados (com idade de 5 semanas) apresentou 5 títulos de IFA em torno de 600, ao passo que as amostras de soro a partir do grupo de controle apresentou títulos de IFA em torno de 200 (Tabela 4 e Figura 6). Após a segunda " imunização, os títulos de IFA em leitões vacinados (com idade de 6 semanas) aumentaram dramaticamente (títulos de IFA são mais altos que 13.000). Com idade de 8 m semanas, os leitões vacinados apresentaram títulos de IFA mais altos que 46.000, ao . 10 passo que leitões não vacinados apresentaram titulos de IFA muito baixos em torno de
170. Tabela 4 Títulos de anticorpo anticepa de PCV2 H de leitões ' vacinados por IFA ldade 2 4 5 6 8 (semana) . Grupo 1 800 200 600 13.440 48.640 Grupo 2 1.680 230 620 20.800 46.720 Grupo 3 1.100 220 650 18.660 49.760 Grupo 4 1.880 210 190 300 170 (Controle)
3.2 Ganho de peso 15 Leitões vacinados apresentaram ganhos de peso mais altos - que os leitões não vacinados no grupo de controle (Tabela 5 e Figura 7). Com idade de 8 semanas, os leitões vacinados estavam em torno de 2 kg mais pesados que os leitões não vacinados. Tabela 5 Pesos corporais de leitões vacinados (kg) ldade 3 4 5 6 .8 (semana) Grupo 1 8,4461 9,9512 12,4207 16,1756 20,5284 Grupo 2 7,3781 9,064 11,7594 15,2267 20,3755 Grupo 3 7,9564 9,5413 12,3461 15,8561 20,4345 Grupo 4 7,5906 8,9899 11,724 12,9102 18,6059 (Controle) 20 Portanto, os resultados indicaram que a vacina contra cepa de PCV2 H inativado da presente invenção teve a capacidade de efetivamente induzir imunorrespostas em porcos, intensificar a imunidade em porcos e assim aumentar o ganho de peso em porcos. Exemplo 9 Prova de eficácia de Vacina contra PCV2 inativado -4
1. Protocolo de vacinação e lnfecção por PCV2 Leitões de quatorze a dezesseis dias de idade foram aleatoriamente divididos em 4 grupos de 5 leitões cada. Todos os 20 leitões foram 5 negativos para anticorpos anti-PCV2. Os leitões nos 3 grupos de vacina (Grupos 1 a 3) foram injetados intramuscularmente com 1 ml de 3 lotes diferentes de vacina contra cepa " de PCV2 H inativado, respectivamente. Duas semanas após a imunização primária (p.i.), os leitões foram reforçados com a mesma dose da vacina. Os leitões no Grupo 4 não " foram vacinados e serviram como controle negativo. 5 semanas após a imunização 10 primária, todos os leitões foram estimulados com estirpe de vÍrus de cepa de PCV2 H (cepa virulenta) a uma dose de doses infecciosas de cultura de tecido 106-° a 50% por ml (10'·° TC|D50/m|). Cada leitão foi estimulado de modo intranasal com 1 ml da estirpe de - " vÍrus e intramuscularmente com 2 ml da estirpe de vÍrus. As amostras de soro e cotonete nasal foram coletadas a 7, 11, 19 e 25 dias após estimulação para detectar viremia de " 15 PCV2 por PCR.
2. Detecção de viremia de PCV2 por PCR Os níveis virais de DNA nas amostras de soro de porco coletadas após estimulação de PCV2 foram determinados com uso de PCR. O DNA viral foi extraído com reagente DNAzoI®. Primeiro, 400 µ1 de reagente DNAzoI® foram 20 adicionados a 200 µ1 de soro e a mistura foi centrifugada a 12.000 rpm/min por 15 minutos. O sobrenadante foi misturado com um volume duplo de etanol absoluto para precipitar o DNA. Após a mistura ser centrifugada a 12.000 rpm/min por 15 minutos, o sobrenadante foi descartado. O pélete de DNA foi lavado com 75% de etanol, centrifugado a 12.000 rpm/min por 15 minutos para remover o etanol e, finalmente, dissolvido em 8 mM de ' " 25 NaOH. Os iniciadores de PCR usados para detectar a viremia de PCV2 têm as seguintes sequências. PCV2-F1: 5' GTGAAGTGGTAI I I IGGTGCC 3' (SEQ ID NO: 8) 30 PCV2-R1: 5' GTCTTCCAATCACGCTTCTGC 3' (SEQ ID No: 9) Os iniciadores PCV2-F1 (diretos) e PCV2-R1 (reversos) foram usados para ampliar um fragmento de 284 bp a partir do ORFI de PCV2. A mistura de PCR com um volume final de 25 µ1 continha 1 µ1 de iniciadores diretos, 1 µ1 de 35 iniciadores reversos, 1,5 µ1 de 25 mM de Mg'", 2,0 µ1 de 2.5 mM de dNTPs, 2,5 µ1 de jQx tampão livre de Mg'", 0,2 µ1 de Taq DNA polimerase, 11,8 µ1 de água destilada e 5 µ1 de DNA padrão. A reação de PCR iniciou com uma etapa inicial de pré-aquecimento da mistura de PCR a 95 "C por 5 minutos e a ampliação de DNA foi conduzida por 38 ciclos com os seguintes parâmetros; desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 30 segundos. A reação de PCR foi compietada com uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C e, em seguida, mantida a 4 °C. Os produtos de PCR foram em seguida analisados em um 1% de gel de 5 agarosa e visualizado por manchamento por brometo de etidio. Além disso, outro par de iniciadores de PCR usado para detectar viremia de PCV2 tem as seguintes sequências. PCV2-F2: 5' TGTTGGCGAGGAGGGTAATG '3 (SEQ ID NO: 10) PCV2-R2: 5' TGGGACAGCAGTTGAGGAGT '3 (SEQ ID NO: 10 11) _ Os iniciadores PCV2-F2 (diretos) e PCV2-R2" (reversos) ' foram usados para ampliar um fragmento de 676 bp a partir de PCV2.
3. Análise Anatômica e Patológica " 15 Após 25 dias desde a estimulação, os Ieitões foram sacrificados e anatomizados para observar anormalidades patológicas em órgãos e coletar pulmões e linfonodos. As amostras de tecido foram fixadas em 4°/0 de formaldeído, embebidas em parafina e, em seguida, seccionadas. As seções de tecido foram manchadas com hematoxilina e eosina (H&E) e vistas com um microscópio.
20 4. Resultados
4.1 Avaliação de Viremia Os resultados de PCR mostraram que em 25 dias após · estimulação, a ocorrência de viremia em Ieitões vacinados (Grupos 1 a 3) foi 40 a 6Õ°/o mais baixa que a ocorrência em leitões não vacinados (Grupo 4) (Tabela 6). Os resultados * 25 indicaram que a vacina contra cepa de PCV2 H inativado da presente invenção teve a capacidade de induzir imunidade em porcos, reduzir a severidade e duração de viremia em porcos e proteger os porcos de infecção por PCV2. Tabeía 6 Viremia em porco soro medida por PCR es da dias após a estimulação Grupo estimulação 7 11 _ 1,9 _ 25 _ Grupo 1 0/5' 2/5 2/5 1/5 1/5 Grupo 2 0/5 2/5 1/5 0/5 0/5 Grupo 3 0/5 3/5 2/5 1/5 1/5 Grupo 4 0/5 4/5 3/5 4/5 3/5 (Controle) ' Os denominadores representam o número de leilões 30 testados e os numeradores representam o número de leitões com viremia.
4.2 Exame Histopatológico Os leitões foram sacrificados e anatomizados em 25 dias após estimulação. A ampliação de linfonodos inguinais, mediastino e mesentéricos foram constatadas em 2 leitões não vacinados e as seções dos linfonodos eram pálidas.
Outros leitão não vacinado apresentou pulmões borrachosos não compactados, edema pulmonar e rins com manchas brancas.
Todos os leitões vacinados apresentaram nenhuma anormalidade patológica corpulenta (Tabelas 7 e 8). Tabela 7 Anormalidades patológicas em vacinados e leitões 5 não vacinados Anormalidade patológica Rins com Leve Outra Grupo Ampliação de Edema manchas ampliação do anormalidade' linfonodos pulmonar brancas baço Grupo 1 0/5' 0/5 0/5 0/5 0/5 Grupo 2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Grupo 3 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 'W Grupo 4 2/5 1/5 1/5 1/5 0/5 (Controle) & " Os denominadores representam o número de leitões anatomizados e os numeradores representam o número de leitões com anormalidades patológicas. bOutras anormalidades incluem leve ampliação de fígado ou 10 veslcula biliar e timpanismo intestinal.
A Tabela 8 mostra o resultados de exame histopatológico microscopicamente de seções de tecido e o resultados de avaliação de viremia de PCV2 por PCR- As Iesões histopatológicas em Iinfonodos como depleção de Iinfócito e infiltração macrófaga foram observadas em quase todos os leitões não vacinados (Grupo 4) e todos 15 os linfonodos amostrados a partir de leitões não vacinados foram positivos para viremia de PCV2. Além disso, as Iesões histopatológicas em pulmões como infiltração de célula inflamatória foram observadas em 3 leitões não vacinados e 2 dos tecidos pulmonares amostrados a partir de leitões não vacinados foram positivos para viremia de PCV2. Comparados com leitões não vacinados, os leitões vacinados exibiram uma redução 20 significante em lesões histopatológicas e viremia de PCV2. As lesões histopatoiógicas em linfonodos foram observadas em somente 1 leitão vacinado (porco n° A4) de 15 (Grupos 1 a 3) e os linfonodos amostrados a partir da leitão vacinado (porco n° A4) foram os únicos linfonodos positivos para viremia de PCV2. Os resultados indicaram que a vacina contra
25 cepa de PCV2 H inativado da presente invenção teve a capacidade de proteger os porcos de infecção por PCV2 e a taxa de proteção foi de 80% a 100°/o.
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Com base em todos qs resultados, a vacina contra cepa de PCV2 H inativado da presente invenção efetivamente induziu a imunidade em porcos, protegeu os porcos vacinados de infecção por PCV2, reduziu a severidade e a duração de viremia em porcos, minimizou os sintomas clínicos e aumentou o ganho de peso corporal.
5 Muitas alterações e modificações na modalidade acima descrita da invenção podem, é claro, ser conduzidas sem sair do âmbito da mesma. Consequentemente, a fim de promover o progresso na ciência e nas técnicas úteis, a invenção é revelada e é projetada para ser limitada somente pelo âmbito das reivindicações anexas.
~ y

Claims (20)

Reivindicações
1. VÍrus circovírus porcino tipo 2 (PCV2) caracterizado pelo fato de que compreenda sequência de genoma da SEQ ID No: 1.
2. VÍrus circovírus porcino tipo 2 (PCV2), de acordo com a 5 reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que foi depositado no China Center for Type Culture Collection (CCTCC) sob número de acesso V201117.
3. VÍrus circovírus porcino tipo 2 (PCV2), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vÍrus PCV2 tem a capacidade de provocar efeito citopático (CPE) em hnhagem . celular PK-15 ou em suas linhagens - - 10 celulares derivadas.
4. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de que . compreende o vÍrus circovírus porcino tipo 2 (PCV2), conforme definido na reivindicação ' 1.
5. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 15 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o veículo é um adjuvante.
7. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 20 4, caracterizada pelo fato de que o vÍrus PCV2 é tratado por um processo de inativação.
8. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vÍrus PCV2 é atenuado; ou uma subunidade, um DNA ou outras formas derivadas e produzidas a partir do PCV2, conforme definido na reivindicação 1. " 25
9. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos um antígeno patógeno selecionado a partir do grupo que consiste em antígeno de VÍrus da Gripe Suína (SlV), antigeno de vÍrus da sÍndrome respiratória e reprodutiva dos porcinos (PRRSV), antígeno de micoplasma, antígeno de parvovírus porcino (PPV), antígeno de erisipela e 30 antígeno de vÍrus da pseudorraiva.
10. Método para proteção de um porco contra a infecção por circovírus porcino tipo 2 caracterizado pelo fato de que compreende inoculação do porco com a composição imunogênica, conforme definido na reivindicação 4, para aumentar a imunidade contra o PCV2 no porco. 35
11. Anticorpo anticircovírus porcino tipo 2 (PCV2) caracterizado pelo fato de que é derivado a partir do vÍrus PCV2, conforme definido na reivindicação 1.
12. Anticorpo anticircovirus porcino tipo 2 (PCV2), de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos um dentre um anticorpo monoclonal, um anticorpo po|ic|ona| e um anticorpo geneticamente modificado.
13. Pdinucleotídeo caracterizado pelo fato de que 5 compreende uma sequência de nucleotÍdeos que codifica um polipeptídeo do vÍrus PCV2, conforme definido na reivindicação 1, sendo que o polipeptideo tem pelo menos uma das sequências dentre SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 e SEQ ID No: 7.
14. Poiinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 13, . caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotÍdeos compreende pelo menos . 10 uma das sequências dentre SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 6.
15. Kit de teste de circovírus porcino tipo 2 (PCV2) caracterizado pelo fato de que compreende uma unidade de detecção que é uma ou mais ' de uma selecionada a partir do grupo que consiste em um antígeno viral do vÍrus, conforme definido na reivindicação 1, um anticorpo derivado a partir do vÍrus, conforme 15 definido na reivindicação 1, um polinucleotÍdeo, conforme definido na reivindicação 13 e um fragmento de ácido nucleico que detecta a sequência da SEQ ID No: 1.
16. Kit de teste de circovirus porcino tipo 2 (PCV2), de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o antígeno viral é depositado em uma placa. 20
17. Kit de teste de circovírus porcino tipo 2 (PCV2), de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o antígeno viral é tratado por um processo de inativação.
18. Kit de teste de circovírus porcino tipo 2 (PCV2), de . acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende " 25 pelo menos um dentre um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal e um anticorpo geneticamente modificado.
19. Kit de teste de circovírus porcino tipo 2 (PCV2), de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotideo compreende pelo menos uma dentre SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 6. 30
20. Kit de teste de circovírus porcino tipo 2 (PCV2), de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ácido nucleico compreende pelo menos uma dentre SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 1OeSEQIDNo:11.
BR112013015675-9A 2010-12-22 2011-12-20 circovísrus porcino tipo 2 (pcv2), composição imunogênica que contém o mesmo, kit de teste e aplicação do mesmo BR112013015675A2 (pt)

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